Nanopore R10.4.1全长 16s rRNA测序研究

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 导读 

长读长扩增子为群落提供了物种水平的解决方案。由于纳米孔测序早期具有高错误率，它在16S rRNA的研究中没有广泛使用。随着测序技术的进步，Nanopore引入了带有Q20+试剂的R10.4.1芯片，实现了99%以上的准确率。目前没有缺乏关于使用R10.4.1芯片对16S rRNA测序的性能的研究，也没有发表关于准确性提高对使用16S ONT数据的分类学（R9.4.1至R10.4.1）的影响的研究。在这项研究中，使用Novaseq、Pacbio Sequel II和Nanopore PromethION平台（R9.4.1和R10.4.1）通过16S rRNA扩增子测序对多种类型的微生物样本进行了研究。在模拟群落样本中，我们展示了错误率、召回率、精确度等指标。R10.4.1和PB平台在环境样本中揭示了类似的微生物组。本研究表明，R10.4.1全长16S rRNA序列可用于环境微生物群的物种鉴定。

2023年10月6日，环境微生物领域业内权威期刊杂志Applied and Environmental Microbiology（简称AEM)在线发表了华中农业大学陈雯莉教授团队的研究成果，ONT 16S rRNA评测文章，文章题目为“The Newest Oxford Nanopore R10.4.1 Full-length 16S rRNA Sequencing Enables the Accurate Resolution of Species-Level Microbial Community Profiling”。华中农业大学博士生张天缘是论文第一作者，武汉贝纳基因的李汉洲和曹健是论文的第二作者和第四作者。

研究思路

本研究应用Oxford Nanopore PromethION平台（R9.4.1和R10.4.1）、Pacbio Sequel II和Novaseq平台通过16S rRNA扩增子测序对3个模拟群落和3个环境样本进行测序。模拟群落包括商业模拟群落Zymo D6305、实验室合成群落S1（丰度差异较大）和S2（丰度差异较小），包含实验室合成群落包含了2对同属物种，其中还有具有高GC基因组含量的链霉菌。针对模拟群落，从reads层面评估错误分布、序列一致性分布和正确分类的reads比例；从种属层面比较了不同方法获得的丰度、召回率、精确度、L1距离等指标。针对环境样品，在种属水平上比较了top15丰度、相关性、分类比例等指标；比较了不同平台获得的alpha多样性和beta多样性结果。

图1 研究设计

主要研究结论

1.结合R10.4.1测序芯片和Kit14试剂盒生成高质量的16S rRNA原始数据

ONT R10.4.1原始下机数据Q值为18.77，过滤掉接头和引物后的Clean reads平均Q值可达22.41（准确度99.42%），相比于R9.4.1明显提升。ONT R10.4.1的错误率相比R9.4.1明显改善，特别是缺失率减少了80.59%，错配率减少了42.80%，但其错误率仍高于PB数据。

图2 ONT R10.4.1测序质量

2.R10.4.1在复杂群落中表现优秀，可检测到极低丰度的物种

在Zymo群落和S2群落的种水平分析中，ONT R10.4.1和PB测序数据都可以获得完整的召回率。针对复杂的S1群落，仅ONT数据获得完整的召回率，其表现更为优秀，且R10.4.1获得了比R9.4.1更小的L1距离。

图3 S1样品不同平台基准测试结果

3.R10.4.1可以检测到更多的种和属分类，且与PB平台具有相似的物种组成和多样性

在真实环境样本的测试中，ONT R10.4.1数据鉴定到的种和属的数量均多于PB数。在环境样品中R10.4.1数据和PB数据检测到共有种和共有属数目通常最多。在土壤样本中，使用LAST分类器比对NCBI数据库时，二者种水平的相关性可达0.990（p<0.05），二者具有接近Shannon指数和Simpson指数。

图4 相关性及多样性分析

4.ONT数据5万条成本低廉且更容易接近饱和，测序结果受分类器影响大于测序平台

当使用LAST分类器时，R10.4.1数据通常更难饱和。对于NW样品，需要至少26,000 条reads才可以达到饱和，但对于HS和YW样品，需要更多reads（~40,000条）。且5万条ONT  reads的成本与3万条PB reads的成本相当。分类器对群落组成的影响高于测序平台对群落组成的影响。

图5 稀释曲线和PERMANOVA分析

研究小结

R10.4.1芯片提高了16S rRNA数据的准确性，可以为研究者提供“种”级别的研究手段，具有更多reads条数和更低价格的优势。

参考文献：

Zhang T, Li H, Ma S, et al. The Newest Oxford Nanopore R10.4.1 Full-length 16S rRNA Sequencing Enables the Accurate Resolution of Species-Level Microbial Community Profiling. Appl Environ Microbiol. 2023

本期关键词推荐：

ONT;16S rRNA;微生物多样性;Nanopore R10.4.1 Flowcell;三代测序

本文为非OA期刊，需要全文的老师请联系贝纳基因（微信号：benagen_com)小编~

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