2020.8.26丨Nanopore甲基化测序产品概述

• 一、Nanopore甲基化
  • 基本概念
    • 甲基化属于表观遗传
    • 遗传学： 基于基因序列改变所致基因表达水平变化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星（SSR） 等
    • 表观遗传学： 指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如DNA甲基化和染色质构象变化等
    • 表观遗传现象：DNA甲基化（去甲基化）、基因组印记、休眠转座子激活、母体效应、基因沉默、核仁显性、RNA编辑等
    • 表观遗传学的常见机制
      • DNA 甲基化：化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现； l 组蛋白修饰
      • DNA去甲基化：组蛋白修饰：甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP 核糖基化
      • 染色质可接近性：经染色质重塑后呈现出松散的状态，被称为开放染色质或可接近性染色质 （ATAC-Seq）
      • 非编码RNA调控
      • 蛋白-DNA互作
  • DNA甲基化类型

    

    • 5-甲基胞嘧啶（5-mC）
      • 基本概念：甲基化C碱基在基因组上的分布包含三种形式（CG, CHG和 CHH，其中H代表A 或T或C碱基）
      • 特点
        • 植物甲基化多发生于CpG、CHG、CHH
        • 哺乳动物甲基化多发生于CpG二核苷酸序列上
        • CpG富集区域多位于基因的启动子区域
        • 位于启动子区域的甲基化一般会抑制转录
      • 作用方式
        • 抑制转录因子的结合， 从而抑制转录过程
        • 结合抑制因子， 从而抑制转录过程 
      • 不同物种甲基化水平
        • 植物中，三种甲基化类型均存在
        • 动物以CpG为主
        • 甲基化具有一定保守性
    • N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）
      • 真核生物中，最常见的甲基化修饰是5-甲基胞嘧啶 胞嘧啶（5mC）
      • 原核生物中，N6-甲基腺嘌呤（6mA，或m6A）是 最普遍的DNA修饰
      • 真核生物表达丰度特别低，尤其是在哺乳动物，每 百万个腺嘌呤中大概只有不到10个位点是6mA
      • 联川做得比较好
      • 特征分布
        • DNA 水平的6mA检测研究物种： 莱茵衣藻、秀丽隐杆线虫、果蝇，蛙，小鼠、人、斑马鱼、猪和水稻等真核物种
        • 6mA位点富集在转录起始位点（TSS）,如莱茵衣 藻
        • 基因组上广泛分布，如秀丽隐杆线虫，水稻
        • TSS位点6mA稀缺，如蛙和小鼠
        • 6mA在重复序列区富集，如果蝇，斑马鱼和小鼠 u 斑马鱼基因组的52.2%是重复序列，而其77%以上 的6mA峰分布落在重复序列区
      • 生物学功能
        • 可能参与基因的转录
          • 莱茵衣藻，TSS附近富集6mA标记，且转录活性和甲基化状态呈现正相关
          • 果蝇中，DMAD介导的去6mA甲基，导致6mA附近的基因或者转座子表达受到抑制，6mA可能介导了 基因或者转座子的活化表达
          • 小鼠的胚胎干细胞（mESC）中，6mA抑制了转座子和邻近基因的表达
          • 6mA与热胁迫关键基因的表达呈正相关
        • 可能参与核小体的定位
          • 莱茵衣藻中, 6mA通常位于核小体之间的linker DNA上，越远离TSS位点，6mA就变得越稀疏有可能是 6mA调节着核小体的定位
        • 可能作为一种表观Marker
          • 斑马鱼胚胎发育的早期，5mC处于去甲基化的状态，而6mA却处于丰 度激增的状态, 此时的6mA可能作为一种补充性的表观marker，控制 着基因的转录表达
        • 销售建议，将5-mC与6-mA一起做，进行联合分析，鉴定同一时期，不同甲基化的关系
    • *7-甲基鸟嘌呤（7-mG） (略)
    • m6A
      • 基本概念
        • RNA甲基化修饰占所有RNA修饰的60%以上， 而m6A是高等生物mRNA和lncRNA上最为 普通的修饰
        • 在RNA层面，哺乳动物的m6A修饰的比例为 0.1-0.4%，平均每条mRNA有3-5个m6A位点
        • 目前miRNA、circRNA、rRNA、tRNA和 snoRNA都可发生m6A修饰
      • 特点：
        • 主要存在于 DRACH 的基序上（D = A/G/U; R = A/G; H = A/C/U）
        • 出现位置存在富集现象：特别是在终止密码子周围、3'非翻译区（3'-UTR）和编码序列（CDS），少数出现在 起始密码子附近，内含子很少
        • 人和小鼠 m6A 位置高度保守
      • 作用方式：
        • 5'端甲基化修饰，主要功能为维持mRNA稳定性、mRNA前体剪切、多腺苷酸化、mRNA运输与翻 译起始等
        • 3'端 polyA修饰有助于出核转运、翻译起始及结合蛋白维持mRNA结构稳定
      • 技术手段：
        • 比色法
        • 液相色谱质谱联用（LC-MS）
        • MeRIP-seq：抗体富集，m6A高甲基化区域
        • miCLIP-seq：抗体富集，紫外交联，单碱基水平
  • 销售建议：
    • DNA甲基化产品
      • 5mC
        • 传统：全基因组甲基化测序WGBS
        • 简化甲基化测序RRBS
        • 甲基化DNA免疫共沉淀测序MeDIP-Seq
      • 6mA
        • 传统：基于免疫沉淀法（6mA-IP）
        • 限制酶切法（6mA-RE-seq）
        • LC-MS/MS法 三代单分子测序法（Pacbio）
      • 产品核心竞争力：ONT检测平台可以同时检测5mC与6mA
      • 缺陷：
        • 价格稍贵——甲基化客户一般经费充足
    • 除非有6mA研究经验，否则不建议向客户推荐。目前产品尚不清楚是否已研发完成
• 二、ONT甲基化平台
  • 建库流程
    • 提取高质量基因组 DNA，利用Nanodrop、Qubit 和 0.35% 琼脂糖凝胶电泳进行 纯度、浓度和完整性质检；
    • 利用gTube将基因组DNA打断成平均8kb左右；
    • 文库构建（官方试剂盒）：
      • DNA 损伤修复和末端修复，磁珠纯化；
      • 接头连接，磁珠纯化；
      • Qubit 文库定量。
    • 上机测序
  • ONT甲基化分析流程
    • Guppy软件进行 basecall
    • Nanopolish 检测 CpG
    • tombo检测CHH (H=A/T/C)， CHG和6mA 位点
  • ONT平台优势
    • 单碱基水平检测，无中间处理（重亚硫酸盐）， 不扩增（NGS测序）、不富集（抗体或酶切）， 真实还原碱基修饰信息
    • 测序读长长（8kb文库），避免短读长带来的拼 接比对错误，鉴定准确 u 相同测序深度，鉴定到的甲基化位点数更多，一 致性占比高（0.97以上）
    • 鉴定种类丰富（5mC & 6mA），多种碱基修饰一 次搞定,数据具有可比性，性价比高（6mA市场 价1W左右）
  • 应用方向
    • 多组学联合

      

      • 植物上特有小RNA与DNA甲基化调控
    • 发育调控

      

      • DNA甲基化一般并不单独起转录调控作用，与其他组学共同调控；
      • DNA甲基化最稳定（不易变化）的调控方式；
      • 不能仅仅关注启动子区，不能仅仅关注单一组学
    • 胁迫
    • 其他（基因印记、基因沉默）
    • 疾病研究
  • 生物学重复（3个）
  • 环境应答与表现修饰
    • 鉴定表型后再取样
    • 行为学结果支持也可以测样
  • 案例（略）
  • 产品类型
    • 二代：WGBS 30X
    • 三代：Nanopore 30X
  • 送样要求
    • DNA总量：
      • 单次建库2ug以上
      • 多次建库4.5ug以上
    • 纯度要求
      • a) OD260/280 在 1.7-2.2 之间；OD260/230 在 1.7-2.3 之间；
      • b) Nanodrop/Qubit 比值 0.8-2.5； 检测峰图正常；
      • c) 澄清无色， 无不可溶解物质；溶液中不含去污剂、 表面活性剂、 变性剂， 螯合剂和高浓度 的盐；
      • d) 无单链 DNA、 RNA、 蛋白质或染料污染。
    • 长度要求
      • a) 平均片段大小： PFGE 或低浓度琼脂糖（0.3%） 检测， >30kb；
      • b) 避免高速涡旋振荡等剧烈方式处理基因组 DNA， 如需混匀， 使用宽口径枪头轻柔吹洗或 颠倒轻叩样本管；
      • c) 切忌反复冻融