2020.9.12丨变异检测的原理&应用方向

• 变异检测的原理&技术要点
  • 定义：变异检测是指 通过测序 技术对某一物种个体或群体的基因组进行测序及差异分析，获得单核苷酸多态性SNP ）、插入缺失 InDel ）、结构变异（ SV ）、拷贝数变异CNV ）等大量的遗传变异信息用于开发分子标记建立遗传多态性数据库，为后续揭示进化关系、挖掘功能基因等奠定数据基础。
  • 按照片段大小分类：
    • 单碱基：SNP
      • SNP （单核苷酸多态性）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性，包括单个碱基的转换、颠换等。利用 GATK软件对群体数据进行变异检测及过滤，进一步 过滤 SNP 的 reads 支持数小于 4 的位点，得到高可信度的 SNP
    • 1-50bp：InDel
      • InDel 是指基因组中小片段的插入和缺失序列，其长度在 1 50bp 之间。我们采用 GATK 软件进行个体 InDel 的检测。 Small InDel 变异一般比SNP 变异少，同样反映了样品与参考基因组之间的差异，并且编码区的 InDel 会引起移码突变，导致基因功能上的 变化。
    • 50-1000bp：SV
      • SV
        • （结构变异）指基因组水平上大片段的插入、缺失、倒置、易位等序列。可利用 Lumpy, Manta, Delly 软件，基于 pair endreads 比对到参考基因组上面的关系及实际 insert size 大小检测样品与参考基因组间的插入（ insertion INS ）、缺失 deletionDEL ）、倒置 inversion INV ）、染色体内部迁移 intra chromosomal translocation ITX ）、染色体间的迁移 interchromosomal translocation CTX 。
    • 大于1000bp：CNV
      • 拷贝数异常
      • (copy number variations, CNVs 是属于基因组结构变异（ structural variation ），根据大小可分为两个层次：显微水平microscopic ）和亚显微水平 ( 。显微水平 的基因组结构变异主要是指显微镜下可见的染色体畸变 , 包括 整倍体或非整倍体、缺失、插入、倒位、易位、脆性位点等结构变 异。亚微水平的基因组结构变异是指 DNA 片 段 长 度 在 1Kb 3Mb 的基因组结构变异 , 包括缺失、插入、重复、重排、倒 位、 DNA 拷贝数目变化等，这些统称为 CNV （也称为拷贝数多态性 (copy number polymorphisms, CNPs ）。
  • 名词解释
    • 测序深度 ：测序得到的总碱基数与基因组大小的比值。
    • 覆盖率： 指测序获得的序列占整个基因组的比例，与测序深度正相关。
    • 比对率（ mapping rate ））：反映了样本测序数据与参考基因组的相似性 需要 70 %%，最好
    • 90% 以上。
• 二、三代变异检测简介&应用方向
  • 简介
    • 全基因组重测序（WGS ））：对基因组序列已知的个体进行全基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。
      • 优势：获得的基因组信息全面，高分文章青睐，循环使用性高
      • 不足：成本高
    • 简化基因组测序：指用限制性内切酶对基因组进行简化，只对酶识别位点相关的 DNA 进行高通量测序。
      • 优点：快速、简便、低成本
      • 不足：
      • 1) 只能获得 SNP 等信息， SV 、 CNV 检测可靠性较低
      • 2) 用酶切的片段进行测序，基因组覆盖度低，获得变异信息不全
      • 3) 建库前需要进行酶切评估，建库分析结果，受酶切评估结果和基因组组装质量所限
      • 4) 多数应用在影响因子 5 分以下的期刊，如 BMC 、 Plos one 等
    • 检测数据量推荐：检测 SNP 5 10 × ；检测 InDel 10 15 × SV 15 20 × CNV 30 ×
  • 检测分析流程
    • 流程图
    • 流程推荐软件
      • 分析流程：使用软件
      • 数据质控：Fastqc
      • 比对：BWA
      • SNP、 InDel 检测 ：GATK
      • SV检测： Manta、 Delly
      • CNV检测 ：CNVnator
      • 注释：ANNOVAR
      • 圈图绘制：Circos
  • 应用方向
    • 基于二代测序检测到的SNP 位点，后续可分别做群体进化、 GWAS 、 BSA 、遗传图谱，具体的应用方向如下所示：
  • 优势和短板
    • 三代优势
      • 长 读长
        • 处理重复区域；
        • 提供连续的基因组装配；
      • 均衡的测序覆盖度
        • 没有偏好性 (GC%, 序列复杂度
        • 能够进行完整基因组测序；
      • 无测序系统偏差
        • Random errors wash out in final consensus 在最终的一致性序列中，去除了随机错误 
        • 提供准确的基因组序列。
    • 二代短板
      • 读长短：导致组装不完全无法跨越重复序列
      • 覆盖度不均一；G/C 或 A/T 富含区域是 重灾区 无法达到真正意义上的全
      • 基因组测序；
        • 扩增等因素导致系统错误 （指测序的准确率
        • 适用于 SNP 检测 不适用大范围的结构变异检测
  • 三代检测类型
    • CLR与CSS
      • 图示
    • 两种测序模式对比
    • CLR检测SV
      • CLR检测SV数据量推荐
        • 构建 CLR 文库， 15 30 × 测序深度时， SVs 检测准确度和检出率在 80 85%
        • 对于大片段 SV 检出率、准确度更高。
        • 图示
      • CLR检测SV混样的可行性
        • 图示
      • CLR检测SV分析流程
        • 图示
    • HiFi变异检测SNP、InDex
      • SNV检测 15 × 可检测到 99.5%的变异，至少需要 10 ×；
      • InDel 17 × 可检测到与 NGS 相当的变异（90% ）；
      • SV 检测15 × 检测到 95% 的变异 。
      • 文献参考
        Accurate circular consensus long
        read sequencing improves variant detection and assembly of a human genome 2019 Nature Biotechnology
      • 分析流程
        • 图示
• 总结
  • 1.与 CLR 相比， HiFi 检测到的SV 边界更好，断点更明显；
  • 2. CLR 变异一般用于检测 SV可以和二代数据联合起来；HiFi 可检测 SNP 、 InDel 、SV 等；
  • 3. CLR 检测推荐测序深度 30 ×以上； HiFi 推荐 15 × 的测序深度。
  • 思路一：有参考基因组
    • CLR ：长读长的优势，碱基准确度相对较差的劣势，建议三代数据检测并结合二代数据进行纠错
    • CCS HiFi ：较高的碱基准确度，可同时检测 SNP/ InDel /SV ，无需二代数据校准
    • 可基于长读长对基因组补 gap ，获得更精确信息。
  • 思路二：无参考基因组
    • CLR ：组装参考基因组
    • CCS HiFi ：较高的碱基准确度，更有利于分型与重复区域的组装，更节省时间周期
    • 组装完成后，基于所测二代和三代数据进行结构变异检测，提高数据利用率。
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