靶向测序分析

靶向测序（Targeted Sequencing）

靶向测序是一种聚焦于基因组中特定区域的高通量测序技术。相比全基因组测序（WGS），靶向测序数据量更小，但灵敏度更高，适合深入研究特定区域的遗传变异。

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1. 技术原理

靶向测序通过选择感兴趣的基因或区域，富集目标片段后进行高通量测序。主要包括以下步骤：

1. 目标区域选择

   ：根据实验需求，选择特定的基因组区域（如癌症相关基因或已知疾病易感区域）。

2. 目标区域富集

   ：通过特定技术（如探针捕获或PCR扩增）富集目标片段。

3. 高通量测序

   ：对富集的片段进行测序。

4. 数据分析

   ：检测目标区域的突变（如SNP、插入缺失、拷贝数变异等）。

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2. 富集技术

靶向测序的核心是目标区域的富集方法，主要包括以下两种：

1. 探针捕获法（Hybridization Capture）

   • 使用标记的寡核苷酸探针与目标区域互补结合，再通过磁珠或其他手段进行捕获。

   • 适合大范围目标区域的捕获，灵活性强。

   • 应用场景：癌症基因组研究、外显子组捕获。

2. 多重PCR扩增法（Multiplex PCR）

   • 使用多对特异性引物对目标区域进行扩增。

   • 速度快、成本低，但不适合捕获非常大的区域。

   • 应用场景：特定基因的变异验证、遗传病检测。

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3. 优势与局限

优势

1. 高灵敏度

   ：适合检测低频变异，尤其是在肿瘤样本中。

2. 低成本

   ：与WGS相比，靶向测序的数据量更小，成本显著降低。

3. 专注性强

   ：聚焦于特定基因或区域，简化了后续数据分析。

4. 灵活性高

   ：可以根据研究目标定制捕获区域。

局限性

1. 覆盖范围有限

   ：仅检测预定义区域，无法发现目标区域外的变异。

2. 偏倚风险

   ：捕获效率可能不均匀，导致某些区域覆盖不足。

3. 变异发现有限

   ：对于未知或远离捕获区域的变异难以检测。

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4. 应用场景

靶向测序广泛用于临床和科研领域，尤其是在需要高效解析特定基因变异的情况下：

1. 遗传病研究

   • 筛查与遗传病相关的候选基因。

   • 快速检测已知疾病相关突变（如囊性纤维化、地中海贫血等）。

2. 癌症基因组学

   • 分析癌症样本中常见的致癌基因（如TP53、KRAS）。

   • 追踪肿瘤进化、监测残余病变和复发。

3. 药物基因组学

   • 检测与药物反应相关的基因（如CYP450家族）。

   • 优化个性化治疗方案。

4. 微生物与病原体检测

   • 靶向检测抗生素耐药基因或病毒基因组（如HIV、COVID-19变种）。

   • 分析病原体间的遗传变异。

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5. 常用平台和技术

靶向测序技术通常基于以下测序平台：

• Illumina

  ：短读长测序，适合小变异的高精度检测。

• Ion Torrent

  ：适合快速检测特定区域变异。

• PacBio/Oxford Nanopore

  ：长读长测序，解析复杂区域（如重复序列、结构变异）。

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6. 发展趋势

• 低成本与高效率

  ：新技术不断优化探针设计和捕获效率。

• 联合多组学分析

  ：结合表观组学、转录组学以获得更全面的生物学信息。

• 实时测序与便携设备

  ：例如，Nanopore技术实现快速、现场测序。

靶向测序是一种高效、灵活的工具，在基因组医学和基础研究中具有不可替代的作用。

靶向测序的分析流程包括数据预处理、变异检测、注释及后续分析，每一步都需要严格按照实验和生物信息学标准进行操作。以下是靶向测序的分析流程：

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1. 数据预处理

1.1 数据质控（Quality Control, QC）

• 目标

  ：评估和过滤低质量数据，确保下游分析的准确性。

• 步骤：

  • 软件：Trimmomatic、Cutadapt。

  • FastQC

    ：生成测序质量报告。

  • MultiQC

    ：整合多个样本的质控报告。

  1. 检查测序质量（如碱基质量分布、接头污染）。

  2. 软件工具：

  3. 根据质控结果进行过滤和去接头：

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1.2 比对（Alignment）

• 目标

  ：将测序读段（reads）比对到参考基因组。

• 步骤：

  1. 选择参考基因组（如人类基因组GRCh38）。

  2. 比对工具：BWA（常用于短读长数据）、Bowtie2。

  3. 输出文件：生成比对结果文件（BAM格式）。

  4. 过滤：去除低质量比对和多重比对reads。

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1.3 比对结果处理

• 目标

  ：优化比对结果，提高变异检测的精度。

• 步骤：

  • 工具：IGV（Integrative Genomics Viewer），查看覆盖度和比对质量。

  • 工具：GATK。

  • 作用：提高变异检测的准确性。

  • 工具：Picard。

  • 作用：标记因PCR扩增产生的重复reads，避免误判变异。

  1. 标记重复序列

     ：

  2. 校正碱基质量（Base Quality Score Recalibration, BQSR）

     ：

  3. 可视化比对结果

     ：

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2. 变异检测（Variant Calling）

2.1 突变检测

• 目标

  ：识别单核苷酸变异（SNP）、插入和缺失（Indel）。

• 工具：
  1. GATK HaplotypeCaller

     ：高精度检测单体型变异。

  2. FreeBayes

     ：适合多样本联合变异检测。

  3. VarScan2

     ：灵敏度高，适合检测低频突变。

2.2 结构变异（Structural Variants, SV）检测

• 目标

  ：检测较大的变异（如拷贝数变异、倒位、融合）。

• 工具：
  • Manta

    ：检测复杂结构变异。

  • CNVkit

    ：专注拷贝数变异分析。

2.3 突变过滤

• 目标

  ：去除假阳性，获得高可信度突变。

• 方法：

  • 设置最小覆盖度和突变频率阈值。

  • 交叉参考公共数据库（如1000 Genomes、gnomAD）。

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3. 突变注释（Variant Annotation）

3.1 基因功能注释

• 目标

  ：将突变与已知基因功能、疾病关联信息联系起来。

• 工具：
  1. ANNOVAR

     ：全面注释突变的功能影响。

  2. SnpEff

     ：快速注释SNP和Indel。

3.2 数据库参考

• 数据库：
  • ClinVar

    ：疾病相关变异数据库。

  • COSMIC

    ：癌症突变数据库。

  • dbSNP

    ：已知单核苷酸变异库。

3.3 优先级排序

• 目标

  ：根据变异的可能致病性对结果排序。

• 评分工具：
  • CADD

    （预测变异功能的评分）。

  • PolyPhen-2

    、SIFT（蛋白功能预测）。

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4. 下游分析

4.1 临床相关性分析

• 目标

  ：评估突变的致病性和临床意义。

• 应用

  ：诊断遗传病、确定癌症驱动基因突变。

4.2 突变频率分析

• 目标

  ：研究群体中突变的分布和进化关系。

• 工具

  ：vcftools、Plink。

4.3 可视化

• 目标

  ：展示分析结果，便于解释和报告。

• 工具：
  • Circos

    ：环形基因组变异展示。

  • maftools

    ：肿瘤突变谱展示。

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5. 报告生成

• 目标

  ：将分析结果转化为用户友好的报告。

• 内容：

  • 样本质量评估。

  • 目标区域覆盖度和均一性。

  • 突变列表及其注释。

  • 临床相关结论（如高危突变）。

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6. 常见问题与解决方法

1. 目标区域覆盖不足

   ：优化探针设计或增加测序深度。

2. 高背景噪音

   ：严格设置过滤参数，去除假阳性。

3. 数据处理耗时长

   ：使用高性能计算或并行化工具。

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这一流程灵活性较高，可根据研究目标（如癌症基因组分析或遗传病筛查）调整细节步骤。

以下是一个完整的靶向测序分析流程的代码框架，使用常用的生物信息学工具（如FastQC、BWA、GATK、VCFtools等）。这些代码适用于一个标准的靶向测序分析流程，包括从原始数据的质控到变异注释。可以根据具体需求和计算环境调整。

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1. 环境准备

确保安装以下工具并设置好环境路径：

• FastQC

• MultiQC

• Trimmomatic

• BWA

• Samtools

• GATK

• VCFtools

• ANNOVAR

2. 运行脚本化

将流程整合为一个Bash脚本：

#!/bin/bash# 靶向测序分析流程# 1. 数据质控fastqc raw_data/*.fastq.gz -o QC_results/multiqc QC_results -o QC_results/trimmomatic PE raw_data/sample_R1.fastq.gz raw_data/sample_R2.fastq.gz \    trimmed_reads/sample_R1_paired.fastq.gz trimmed_reads/sample_R1_unpaired.fastq.gz \    trimmed_reads/sample_R2_paired.fastq.gz trimmed_reads/sample_R2_unpaired.fastq.gz \    ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:50
# 2. 比对bwa mem -t 8 -M reference/genome.fa \    trimmed_reads/sample_R1_paired.fastq.gz \    trimmed_reads/sample_R2_paired.fastq.gz > aligned_reads/sample.samsamtools view -bS aligned_reads/sample.sam | samtools sort -o aligned_reads/sample.sorted.bamgatk MarkDuplicates -I aligned_reads/sample.sorted.bam -O aligned_reads/sample.sorted.markdup.bam \    -M aligned_reads/sample.markdup_metrics.txtsamtools index aligned_reads/sample.sorted.markdup.bam
# 3. 变异检测gatk HaplotypeCaller -R reference/genome.fa -I aligned_reads/sample.recal.bam \    -O variants/sample.raw.vcfgatk VariantFiltration -R reference/genome.fa -V variants/sample.raw.vcf \    --filter-expression "QUAL < 30.0 || DP < 10" --filter-name "LowQual" \    -O variants/sample.filtered.vcfbcftools view -f PASS variants/sample.filtered.vcf > variants/sample.passed.vcf
# 4. 注释convert2annovar.pl -format vcf4 variants/sample.passed.vcf > annotation/sample.avinputtable_annovar.pl annotation/sample.avinput humandb/ \    -buildver hg38 -out annotation/sample -remove \    -protocol refGene,clinvar_20230101,cosmic70 -operation g,f,f -nastring . -polish
# 5. 报告multiqc QC_results/ -o final_report/cp variants/sample.passed.vcf final_report/cp annotation/sample.hg38_multianno.txt final_report/cp QC_results/sample.coverage_metrics.txt final_report/echo "靶向测序分析完成，结果保存在 final_report/ 文件夹中"

将此脚本保存为targeted_seq_pipeline.sh并运行：

bash targeted_seq_pipeline.sh

注意

• 更改路径和参数以适应您的实验设计和数据格式。

• 确保输入文件的完整性和参考基因组的一致性。

生信大白记第42记，就到这里，关注我！

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