单细胞分析（10）——scRNA-seq 双细胞（Doublet）筛选

scRNA-seq 双细胞（Doublet）筛选

1. 背景介绍

1.1 什么是双细胞？

在单细胞转录组测序（scRNA-seq）过程中，实验技术的不完美可能会导致两个或多个细胞共享相同的条形码（barcode），形成 双细胞（doublets）。这些细胞会影响数据分析的准确性，导致错误的细胞类型鉴定、伪影（artifacts）和假阳性信号。

1.2 为什么需要去除双细胞？

双细胞的存在会对单细胞分析造成以下影响：

• 扰乱细胞聚类（clustering），影响细胞类型定义
• 影响差异表达基因分析（DEG）
• 误导轨迹推断（trajectory inference）
• 影响肿瘤微环境和免疫细胞的正确解析

1.3 现有的双细胞鉴定工具

目前有多种方法用于双细胞鉴定，例如：

• DoubletFinder（推荐，准确性较高）
• Scrublet（适用于 Python）
• DoubletDetection
• cxds/bcds/hybrid
• DoubletDecon

根据Cell Systems 2021年的研究，DoubletFinder 在准确性上表现最佳，因此本教程采用 DoubletFinder 进行双细胞去除。

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2. DoubletFinder 过滤双细胞的流程

DoubletFinder 主要基于 PCA 降维 + KNN 近邻搜索，通过模拟伪双细胞（artificial doublets）来预测真实数据中的双细胞。

2.1 数据预处理

在去除双细胞之前，首先需要对 scRNA-seq 数据进行标准的预处理。

# 读取数据
sc_data = readRDS(file = './tmp/scRNA_qc_list.RDS')

# 合并多个样本
sc_merged <- sc_data[[1]]
for (i in 2:length(sc_data)) {
  sc_merged <- merge(sc_merged, y = sc_data[[i]], project = "merged")
}
sc_merged$samples = sc_merged$orig.ident
rm(sc_data)

# 数据标准化和降维
combo <- sc_merged
combo <- SCTransform(combo, vars.to.regress = c("nCount_RNA", "nFeature_RNA", "percent.hb", 
                                                "percent.platelet", "percent.heatshock"), verbose = TRUE)
combo <- RunPCA(combo, npcs = 100)

# 选择 PCA 维度
ElbowPlot(combo)

2.2 选择最佳 PCA 维度

使用 ElbowPlot 选择合适的 PCA 维度，通常选择拐点处的维度，例如 前 50-60 个主成分。

combo <- FindNeighbors(combo, reduction = "pca", dims = 1:60)
combo <- FindClusters(combo, resolution = 0.7)
combo <- RunUMAP(combo, reduction = "pca", dims = 1:60, seed.use = 123)

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2.3 运行 DoubletFinder

DoubletFinder 需要 计算最佳 pK 值，这是用于识别双细胞的关键参数。

(1) 计算最佳 pK

combo.list <- SplitObject(combo, split.by = "samples")

pkchoose.list <- list()
for (i in 1:length(combo.list)) {
  seu_temp <- combo.list[[i]]
  
  sweep.res.list <- paramSweep_v3(seu_temp, PCs = seu_temp@commands$RunUMAP.SCT.pca$dims, sct = TRUE)
  sweep.stats <- summarizeSweep(sweep.res.list, GT = FALSE)
  
  # 计算最佳 pK
  sweep.stats.pk <- find.pK(sweep.stats)
  pK=as.numeric(as.character(sweep.stats.pk$pK))
  BCmetric=sweep.stats.pk$BCmetric
  pK_choose = pK[which(BCmetric %in% max(BCmetric))]
}

(2) 计算双细胞比例

nExp_poi <- 0.0059 * nrow(seu_temp@meta.data)

(3) 运行 DoubletFinder

seu_temp <- doubletFinder_v3(seu_temp, PCs = seu_temp@commands$RunUMAP.SCT.pca$dims, 
                             sct = TRUE, pN = 0.25, pK = as.numeric(pK_choose), nExp = nExp_poi, 
                             reuse.pANN = FALSE)

combo.list[[i]] <- seu_temp

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2.4 整合双细胞结果

doublet.cell.list <- list()
doublet.df <- list()
for (i in names(combo.list)) {
  seu_temp <- combo.list[[i]]
  doublet.sub <- seu_temp@meta.data[, grepl("DF", colnames(seu_temp@meta.data)), drop = F]
  doublet.df[[i]] <- doublet.sub
  doublet.cell.list[[i]] <- rownames(doublet.sub)
  sc_merged <- AddMetaData(sc_merged, doublet.sub, paste0("Doublet.", i))
}

# 汇总双细胞识别结果
sc_merged$Doublet.Call <- apply(sc_merged@meta.data[, c(9:16)], 1, function(x) x[!is.na(x)][1])

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3. 结果可视化

DimPlot(sc_merged, group.by = "Doublet.Call", reduction = "umap") + ggtitle("Doublet Identification")

table(sc_merged$Doublet.Call)

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4. 结果保存

saveRDS(sc_merged, file = './tmp/scRNA_qc_withDoublet.RDS')

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5. 结论

• 双细胞（doublets）是 scRNA-seq 分析中的常见问题，需要在分析流程中加以去除。
• DoubletFinder 是目前准确性较高的方法，适用于 Seurat 处理的单细胞数据。
• 正确选择 pK 和 nExp 计算参数，可以显著提高双细胞检测的准确性。
• 去除双细胞后，数据的聚类、差异分析、轨迹推断的可信度将会更高。