一篇文章讲清RNA-seq原理与应用 | 生信笔记07

简介

RNA测序（RNA-Seq、转录组）是一种高通量测序技术，用于研究细胞中的RNA群体，包括mRNA、非编码RNA、小RNA等。这项技术为我们提供了一个全面了解基因表达、识别转录本结构、研究RNA编辑和变异以及发现新的RNA分子的手段。RNA-Seq的基本步骤包括RNA提取、RNA分离和富集、cDNA合成、文库构建和测序。

事实上，比起RNA——表型，蛋白质能更好地与表型联系起来。毕竟RNA大多数情况承担了遗传信息传递的中间信使的职责。但是要做蛋白质组的话，目前的技术还有一定的局限性：蛋白质组数据更难解读，异质性更大，成本更高（要使用质谱），蛋白质存在翻译后修饰……

转录组实际上应用的场景更多，而且现在价格也相当便宜。

来源：21.stat115 chapter 4.1 rna-seq applications_哔哩哔哩_bilibili

RNA-seq的应用

最常见的：

• 在特定情况下的基因表达差异（比如把斑马鱼放到不同温度下，看一下有哪些基因和低温响应有关。或者正常生理状况和患病的状况）

• 基因敲除后的基因表达（是否有剂量补偿效应？）

• 新转录本或新基因的发现（人类有2w左右基因，但是有5w左右的转录本。大多数情况下，基因组数据只是做一个参考，我们并不能直接从中知道mRNA表达产物的情况。而且还有可变剪切的存在）

• 发现基因突变（在转录本中就发现单个碱基都突变，而不需要做全基因组测序或者基因克隆）

• 在不知道基因组的情况下预测基因（在RNAseq时，可以选择无参考基因组的比对方式）

• 发现融合基因（易位导致的致癌基因）

RNA QC（质控）

因为RNA保存比DNA难很多，降解的RNA往往非常难用于测序建库。比如储存时间过长，长的RNA往往更加不稳定…….

电泳检测RNA质量

对RNA跑胶，使用DV200指标来检测RNA的质量，即>200bt 的片段占的比值，因为mRNA的长度往往超过200bp。DV200>30%是一个不错的值

from:22.stat115 chapter 4.2 rna-seq experimental design_哔哩哔哩_bilibili

计算机的方式

显然，有不错的软件来进行QC的部分操作，如FASTQC，快捷，并且有可视化的方式来查看RNAseq的质量。

通常刚开始的几个bp总是质量较差

实验设计

建库前处理

• 使用试剂盒或者一些实验操作来去除rRNA、tRNA（这些RNA的含量占比极高，但通常不是我们想要研究的对象）

• 根据mRNA的末端ployA，来得到mRNA，这是最常用的（这里收集到的RNA是经过可变剪切、移除了内含子，没有tRNA和rRNA的）

• strand特异的方法，可以识别lncRNA（因为lncRNA可能没有标准的翻译框）

根据不同的实验目的选择不同的实验方案。

现在常见的测序是illumina 双端 150bp的配置。

话费200$ 就可以得到5亿个这样的reads，通常会有几十Gb的下机数据（raw data）

重复设计

RNA-seq实验中需要做重复，其中分为技术重复和生物学重复。

• 简单来说，技术重复（technical repeat）就是使用同一个样本，用相同的流程进行测序。多次重复，求SE，然后看准确度。对于RNAseq来说，这样操作的差异并不会很大，在实际操作中不推荐（即分开建库、分开测序）。

• 生物学重复就更加普遍了，也是非常basic的操作，防止批次效应。同一个处理，只要需要3次以上的生物学重复。

应该设计多少的生物学重复？

• 1个：作为预实验，粗略看一下效果

• ≥2：适合对于细胞系的实验

• ≥3：对于动物实验

• 更多：对于人类样本，需要更加严谨大规模的重复

RNA-seq Alignment

BWA？

还记得我第一次做转录组的时候，就用了BWA进行比对。印象很深刻，但是老师和我说，RNA-seq有很多比对软件，唯独不能用BWA。

因为BWA主要用于DNA比对，不能跨过内含子，而我们知道对RNA反转录再测序的话，就会丢失内含子的序列。

所以需要用到TopHat、HISAT、STAR这样的剪切敏感比对（splice aware alignment）软件

from：23.stat115 chapter 4.3 rna-seq alignment_哔哩哔哩_bilibili