三代测序数据分析实战

三代测序数据分析实战

• 主讲人：徐怡

浙江大学医学院博士，迪安诊断研发中心生物信息工程师，负责 NGS 遗传检测。

背景介绍

从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。

第三代测序技术目前已经成为科研领域不可或缺的一种主流技术，广泛应用于基因组 Denovo、全长转录本检测、宏基因组、重测序和变异检测等多个方向，并且在染色体结构变异（SV）的检测中有着不可替代的优势。

第三代测序技术目前存在着错误率较高的瓶颈，生物信息学分析软件也不够丰富，但是未来随着准确度的提升、平行测序能力和酶活性等问题的解决，第三代测序技术是未来发展的重要技术趋势，实现大规模商业化将是大势所趋。

测序技术发展历程

三代测序技术介绍

第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，不仅实现了对每一条DNA分子的单独测序，并且避免了潜在的PCR扩增错误和偏好性。

第三代测序技术目前已经成为科研领域不可或缺的一种主流技术，广泛应用于基因组Denovo、全长转录本检测、宏基因组、重测序和变异检测等多个方向，并且在染色体结构变异（SV）的检测中有着不可替代的优势。

三代测序技术优点

• 读长长
• 测序速度快
• 三代测序设备小型化，便捷，稳定性好

三代测序技术缺点

• 成本偏高
• 错误率较高
• 生物信息学分析软件不够丰富

趋势

未来随着第三代测序技术的准确度提升、平行测序能力和酶活性等问题的解决，第三代测序技术是未来发展的重要技术趋势，实现大规模商业化将是大势所趋。

三代测序平台及原理介绍

三大主流平台

测序方法/平台	公司	方法/酶	平均测序长度	技术原理
HeliScope	Helicos	边合成边测序/DNA聚合酶	30-35 bp	单分子荧光测序
SMRT	Pacific Biosciences	边合成边测序/DNA聚合酶	100000 bp	单分子荧光测序
Nanopore sequencing	Oxford Nanopore	电信号测序/核酸外切酶	无限长	纳米孔测序

SMRT

PacBio SMRT（single molecule real time sequencing）技术应用了边合成边测序的思想，并以SMRT 芯片为测序载体。

基本原理：

DNA 聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基（即dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。

注：DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一，读长主要跟酶的活性保持有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。

测序步骤：

（1）聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部；
（2）4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部；
（3）荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光；
（4）荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基；