DNA甲基化比对：Bismark

建立基因组索引
调用bowtie2，因为bowtie2支持插入缺失。

bismark_genome_preparation
		--path_to_bowtie /usr/local/bowtie/
		<path_to_genome_folder> 参考基因路径
 		--verbose 输出log信息

比对

bismark --bowtie2 
	    -N 0      允许错配数
	    -L 20    seed大小
	    --quiet 
	    --un      过滤多处匹配reads
	    --ambiguous   多处匹配reads信息独立记录
	    --sam   输出格式为sam
	    -o  输出目录
	    <genome_folder>
	    -1 read_1.fq
	    -2 read_2.fq

去重复
duplicate_bismark -p <input.sam>

提取甲基化位点

bismark_methylation_extractor
	-P pair-end
	--comprehensive    输出CHG CHH CpG的甲基化信息
	--no-overlap 
	--bedGraph   输出bedGraph文件
	--counts 每个C上甲基化reads和非甲基化reads的数目
	--buffer_size 20G
	--report  一个甲基化summay
	--cytosine_report  报道全基因组所有CpG
	--genome_folder  <path_to_reference_genome>
	input.sam
	-o output_dir

解读甲基化信息
bismark2report --dir <output_dir> --alignment_repot <report_path>
针对所有样本进行汇总.
bismark2summary sample_bismark_bt2.bam

结果解读
CpG：甲基化C下游是个G碱基。
CHH：甲基化C下游的2个碱基都是H（A、C、T）。
CHG：甲基化的C下游的2个碱基是H和G。

col1 : 比对上的序列ID
col2 : 基因组正负链：+ -
col3 : 染色体编号
col4 : 染色体位置
col4 : 甲基化C的状态（XxHhZzUu）

X 代表CHG中甲基化的C
x  代笔CHG中非甲基化的C
H 代表CHH中甲基化的C
h  代表CHH中非甲基化的C
Z  代表CpG中甲基化的C
z  代表CpG中非甲基化的C
U 代表其他情况的甲基化C(CN或者CHN)
u  代表其他情况的非甲基化C (CN或者CHN)

记录样本甲基化的汇总信息。

col1 : position
col2 : 甲基化count
col3 : 非甲基化count
col4 : 甲基化率（beta）
col5 : coverage

col1 : 染色体编号
col2 : 染色体起始位置
col3 : 染色体终止位置
col4 : 甲基化率 （5/5+6）
col5 : 甲基化数目
col6 : 非甲基化数目 

col1 : 染色体编号
col2 : 染色体起始位置
col3 : 正负链信息
col4 : 甲基化碱基数目
col5 : 非甲基化碱基数目
col6 : CG
col7 : CG背景（CG+一个碱基）