生物软件安装与使用--2FastQC

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1 简介

• 作用：FastQC 可以快速多线程地对测序数据（基因组测序、ChIP-Seq、RNA-Seq、BS-Seq等）进行质量评估（Quality Control）。

• Fast文件展示

@A00313:82:H3MHGDSX7:4:1101:1515:1016 1:N:0:CCGAAGTACGTCCAGGTCAAAGATGAGCACGTTGCGCTCCCCCTTGCCGGTCCTGTCCAGGCCGTAGGCGATGGCGGCGGCAGTGGGCTCGTTGATGATCCTCAGCACGTTGAGCCCCGCGATCACCCCCGCGTCCTTGGTGGCCTGGCGCTGCGAGT
+
FF,FFF:F,:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:F:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFF:FFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFF,FF

Line1： @”开头， 唯一的序列ID标识符， 可选的序列描述内容， 以空格分开。

line2： 序列字符（核酸/氨基酸）

line3： “+”开头， 空或加第一行“@”后的相同内容

line4： 碱基质量字符， 每个字符对应第二行相应位置碱基或氨基酸的质量

2 软件安装

• FastQC基于java环境，需要先安装java

2.1 安装Java

### 下载Java-----------------
# 连接 Java，下载tar.gz文件
wget https://download.oracle.com/java/21/latest/jdk-21_linux-x64_bin.tar.gz
# 解压
tar -xvf jdk-21_linux-x64_bin.tar.gz
# 获取路径
pwd
/public2/home/wu_yl/honghao

### 设置环境变量---------------
vi ~/.bash_profile  # 进入bash_profile  vi编辑器

# 在vi编辑器中末行，输入以下指令
# 按住 a 进入输入状态
export JAVA_HOME=/public2/home/wu_yl/honghao       # pwd中获取到的路径
export CLASSPATH=.:$JAVA_HOME/lib:$JAVA_HOME/jre/lib
export PATH=$PATH:$JAVA_HOME/bin:$JAVA_HOME/jre/bin

# 单机ESC，进入命令行模式
# :w   保存文件 
# :q   退出编辑器模式

### 检查是否安装成成功--------------
java -version

2.2 安装FastQC

wget --no-check-certificate https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/fastqc_v0.12.1.zip
# 因证书不安全，所以 添加指令 --no-check-certificate 表示直接下载，不用考虑安全性

## 配置环境变量
~/honghao/FastQC/fastqc -h
echo 'export PATH=~/honghao/FastQC:$PATH'>>~/.bash_profile
source ~/.bash_profile

3 软件使用

fastqc  *.fq.gz  -t 4  [-o outputdir]  [--(no)extract]  [-f fastq|bam|sam]  [-c contaminantfile]
fastqc  *.fq.gz  -t 4  -o outputdir  -f fastq

## 使用xftp将fq文件上传至服务器
## 解压
pwd
# /public2/home/wu_yl/honghao/input
gunzip MVC_1.raw.R1.fq.gz

pwd
# /public2/home/wu_yl/honghao
# Help
fastqc -h

# Run FastQC，注意，\后不能有空格，最好执行下面一行代码
fastqc \                    	 # 执行FastQC软件
-o results/1_initial_qc/ \ 		 # 设置文件输出目录为"results/1_initial_qc/"
--noextract \         			 # 用于指定在分析完成后不要解压缩原始数据
input/MVC_1.raw.R1.fq			 # 输入数据的路径，即FastQC要分析的样本数据文件路径和文件名

fastqc -o results/1_initial_qc/ --noextract input/MVC_1.raw.R1.fq

4 结果解读

4.1 总览

● 绿色代表PASS
● 黄色代表WARN
● 红色代表FAIL

4.2 Basic Statistics

Basic statistics是该fastq一些基本信息
包含：
● Filename:文件名
● File type: 文件类型
● Encoding：测序平台的版本和相应的编码版本号，用于计算Phred反推error P时用
● Total Sequences: 输入文本的reads的数量
● Sequence length: 测序长度
● %GC: GC含量，表示整体序列的GC含量，由于二代测序GC偏好性高，且深度越高，GC含量会越高。

4.3 Per base sequence quality

● 横轴为read长度，纵轴为质量得分，Q = -10*log10（error P）。
● 柱状表示该位置所有序列的测序质量的统计，柱状是25%~75%区间质量分布，
● error bar是10%~90%区间质量分布，蓝线表示平均数
● 一般要求所有位置的10%分位数大于20，即大于最多允许该位置10%的序列低于Q20。
● 当任何碱基质量低于10，或者任何中位数低于25报WARN,需注意；当任何碱基质量低于5或者任何中位数低于20报FAIL。

4.4 Per base sequence content

● 统计在序列中的每一个位置，四种不同碱基占总碱基数的比例，检测有无AT、GC分离的现象。
● 横轴为位置，纵轴为百分比。正常情况下四种碱基出现的频率应是接近的，且没有位置差异，因此好的样品中四条线应该是平行且接近的
● 由于刚开始测序仪状态不稳定，造成前几个碱基有波动。在reads 开头出现碱基组成偏离往往是我们的建库操作造成的，比如建 GBS 文库时在 reads 开头加了 barcode；barcode的碱基组成不是均一的，酶切位点的碱基组成是固定不变的，这样会造成明显的碱基组成偏离
● 在 reads结尾出现的碱基组成偏离，往往是测序接头的污染造成的。
● 当所有位置的碱基比例一致现出偏差时，即四条线平行且分开，代表文库有偏差，或测序中的系统误差
● 当部分位置碱基的比例出现偏差时，即四条线在某些位置纷乱交织，则有overrepresented sequence的污染。
● 当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%，报"WARN"
● 当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过20%，报"FAIL"。

4.5 Per sequence GC content

● 横轴表示GC含量，纵轴表示不同GC含量对应的read数
● 蓝线是理论分布（正态分布，通过从所测数据计算并构建理论分布），红色是实际情况，两个比较接近判为好的。
● 曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差(overrepresentedreads)
● 形状接近正态分布但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差
● 如果出现两个或多个峰值，表明测序数据里可能有其他来源的DNA序列污染，或者有接头序列的二聚体污染。
● 偏离理论分布的reads超过15%时，报"WARN"；偏离理论分布的reads超过30%时，报"FAIL"

4.6 Per base N content

● 当出现测序仪不能分辨的碱基时会产生N
● 横轴为碱基分布，纵轴为N比率
● 当任一位置N的比率超过5%报WARN，超过20%报FAIL。

4.6 Adapter Content

● 横轴表示碱基位置，纵轴表示百分比。
● 当fastqc分析时没有选择参数-a adapter list时，默认使用图例中的4种通用adapter序列进行统计。
● 若有adapter残留，后续必须去接头

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