项目文章PBJ | 转录因子ChIP-seq助力揭示真菌与水稻互作抑制水稻免疫的新机制

由稻曲菌（Ustilaginoidea virens）引起的水稻假黑穗病（Rice false smut, RFS）是全球水稻（Oryza sativa）种植区最重要的疾病之一。RFS不仅会导致水稻减产，还会因产生环状肽类真菌毒素而潜在威胁人类和动物健康。通过遗传编码引入抗性是一种环境友好且经济有效的控制植物疾病的途径。然而，目前对RFS具有抗性的品种和基因资源仍然极其稀缺，难以鉴定针对RFS的主要抗性基因。揭示稻曲菌效应子的功能以及水稻与稻曲菌互作的分子机制，有助于发现与抗病相关基因的分子探针。

近日，华中农业大学/安徽农业大学稻曲病研究团队在植物科学权威期刊《Plant Biotechnology Journal》上在线发表了题为“Ustilaginoidea virens secreted effector UvSec117 hijacks OsWRKY31-OsAOC module to suppress jasmonic acid-mediated immunity in rice”的研究论文，鉴定到一个调控稻曲病抗性的水稻转录模块OsWRKY31-OsAOC，并发现了稻曲菌效应蛋白可操纵OsWRKY31-OsAOC模块抑制水稻茉莉酸介导的免疫响应，进而促进稻曲菌侵染。爱基百客为本文提供了ChIP-seq技术服务。

研究路线 

研究结果 

之前的研究已经确定了UvSec117作为U. virens的关键毒力效应蛋白，并在筛选与UvSec117互作的蛋白质时发现了水稻转录因子OsWRKY31。WRKY转录因子在植物的发育和生物/非生物胁迫响应中具有多种调控作用，但对于WRKY基因在植物抗谷物感染病原体方面的调控功能却知之甚少。

在本研究中，作者通过定向酵母双杂交实验证实了UvSec117和OsWRKY31之间的相互作用（图1a）。在水稻原生质体瞬时共表达OsWRKY31-Flag和UvSec117-GFP构建体的Co-IP实验中，UvSec117被OsWRKY31免疫沉淀（图1b）。在利用大肠杆菌纯化的重组OsWRKY31-GST和UvSec117-His进行的pull-down实验中，OsWRKY31-GST被包被有UvSec117-His的His磁珠拉下（图1c）。此外，作者还在烟草叶片中通过荧光互补成像（LCI）实验证实了UvSec117和OsWRKY31之间的相互作用（图1d）。当在水稻原生质体中瞬时共表达UvSec117-cYFP和OsWRKY31-nYFP构建体并进行双分子荧光互补（BiFC）实验时，在细胞核中检测到了YFP（黄色荧光蛋白）荧光（图1e）。综上所述，这些结果表明UvSec117在体内和体外均与OsWRKY31相互作用。

图1.UvSec117操纵OsWRKY31-OsAOC模块，抑制茉莉酸介导的水稻免疫

为探究OsWRKY31在抗RFS真菌或其他水稻病原体中的作用，作者培育了OsWRKY31基因敲除突变植株（wrky31）和OsWRKY31过表达转基因水稻株系（OsWRKY31-OE）。wrky31 和OsWRKY31-OE植株的农艺性状与野生型日本晴（NPB）相似。在接种不同的水稻病原体后，OsWRKY31-OE植株较NPB植株更不易感病，而wrky31植株对RFS、白叶枯病、稻瘟病和纹枯病的易感性高于NPB植株（图1f - i），这表明OsWRKY31正向调节水稻对多种病害的抗性。

为了鉴定转录因子OsWRKY31的下游靶基因，作者使用anti-Flag抗体对OsWRKY31-OE植株进行了ChIP-seq实验。总共鉴定了4626个peaks，这些峰值中的绝大多数（超过60%）位于基因区域内，并且在启动子区域高度富集（图1j）。MEME分析显示，大多数OsWRKY31结合的DNA motifs包含序列TTGTACTT、GGGCCCAC或CCCCTTTT（图1k）。GO富集分析显示，目标基因富集于诱导系统性抗性和水杨酸（SA）/茉莉酸（JA）介导的信号通路（图1l）。RT-qPCR显示，在wrky31-1植物中，关键的JA生物合成基因OsAOC（ALLENE OXIDE CYCLASE）显著下调，ChIP-qPCR确认OsWRKY31结合到OsAOC的启动子（图1m）。水稻中OsAOC的敲除增加了其对RFS（图1n）的敏感性。在烟草中表达OsWRKY31显著增强了来自OsAOC启动子驱动的萤火虫荧光素酶（LUC）活性。与OsAOCpro-LUC共渗透的UvSec117抑制了OsWRKY31诱导的LUC活性，而GFP的共渗透则没有（图1o）。酵母单杂交结果表明OsWRKY31可以结合OsAOC的启动子（图1p）。EMSA结果表明OsWRKY31-His特异性结合到OsAOC启动子，与UvSec117预孵育减少了OsWRKY31的DNA结合活性（图1q），表明UvSec117直接抑制了OsWRKY31的DNA结合活性。此外，JA的含量在wrky31-1水稻小穗中显著低于 NPB水稻小穗；在HE-1（UvSec117 转基因植物的异源表达）水稻小穗中显著低于EV（空载体转基因植物）水稻小穗（图 1r）。这些结果表明，OsWRKY31调节的JA介导的防御被UvSec117抑制。

在本研究中，作者发现转录因子 OsWRKY31 是广谱抗病性的关键正向调节因子。在此，作者提供了OsWRKY31全基因组范围内的综合结合图谱及其调控网络，并进一步描述了一个此前未知的调控作用，即 OsWRKY31 介导 JA 介导的信号通路来调节植物免疫。总的来说，本研究揭示了稻曲病菌（U. virens）采用的关键致病策略，分泌效应因子UvSec117抑制OsWRKY31与诸如OsAOC等靶基因启动子的结合，从而抑制JA介导的防御（图1s）。此外，本研究强调了OsWRKY31作为协调多病原体抗性的关键组成部分的关键作用，进一步突显了其在植物防御机制中的重要性。本研究中生成的OsWRKY31-OE株系可能为水稻抗病育种提供有价值的种质资源，具有重要的理论和实践价值。

·  爱基百客王牌产品ChIP-seq简介 · 

· ChIP-seq相关介绍 ·

ChIP-seq技术将染色质免疫共沉淀和二代测序技术结合，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，可用于组蛋白修饰、RNA聚合酶、转录因子和辅因子以及G4链体（G4）等方面的研究，技术成熟稳定。爱基百客ChIP-seq可提供：

• ChIP-seq测序分析

Peak分析: Peak注释和分布分析，Peak关联基因的GO、KEGG的注释和富集分析， 转录因子和Motif分析等。

多样本差异分析：差异 Peak 分布情况统计，差异 Peak 关联基因GO、KEGG 功能注释与富集，转录因子预测，Motif 预测等。

·  后续验证

01 ChIP-qPCR

分析组蛋白修饰/转录因子与染色质区域的结合情况，揭示染色质状态和基因表达调控之间的关系，真实反映结合特性。

02 EMSA

基于DNA-蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中的迁移率不同，检测活化的与DNA结合的蛋白转录或调节因子。

03 双荧光素酶报告实验

检测转录因子与靶启动子的特异结合。

• ChIP-seq+转录组关联分析

ChIP-seq和转录组关联分析可以做以下2个方面的研究：

1、DNA结合蛋白和基因表达调控：通过ChIP-seq技术可以确定DNA结合蛋白（如转录因子）的结合位点，然后与转录组数据结合分析，可以获得转录因子直接调控的靶基因，为全面理解转录因子调控功能提供依据。

2、组蛋白修饰和基因表达：ChIP-seq可以用于鉴定组蛋白修饰的位点，结合转录组数据可以了解这些修饰对基因表达的影响。

·  爱基百客ChIP-seq三大优势

优势一：项目经验丰富，研究物种200＋种，累计实验2000余次。全面覆盖医口和农口等不同样本，不惧特殊样本（如脂肪组织、高淀粉组织和真菌类），抗体经验也极其丰富（多种组蛋白修饰、转录因子、标签抗体以及p300和RNApol II等均有涉及）；

优势二：提供前期实验设计、测序、分析以及后期验证（ChIP-qPCR、EMSA）一站式服务；

优势三：项目文章多次发表于Science、Cancer Cell、Nature Plants、Nature Metabolism以及Plant Cell等期刊。