泛癌单细胞解剖揭示表型不同的B细胞亚型

前言

Pan-cancer single-cell dissection reveals phenotypically distinct B cell subtypes - PubMed (nih.gov)

癌症免疫疗法的成功激发了对整体肿瘤生态系统的深入探索，尤其是肿瘤微环境 （TME） 的免疫方面。1肿瘤浸润 T 细胞和髓系细胞的功能状态和异质性的综合图表2,3启发了多种新颖的治疗策略。尽管如此，只有一些患者实现了持久的反应，而且不同癌症类型之间的反应率差距很大。4在泛癌水平上全面了解 TME 是充分释放人类癌症免疫监测潜力的必要条件。B 细胞作为免疫系统的核心组成部分，在免疫中发挥着重要作用，5,6但它们受到的关注不成比例地减少，因为肿瘤浸润 B 细胞 （TIBs） 的组成和功能异质性没有得到系统检查。

新兴研究已开始破译 B 细胞在抗肿瘤免疫中的功能作用。在卵巢癌 （OV） 和肾癌 （RC） 中，据报道，终末分化的 B 细胞浆细胞 （PC） 会产生抗肿瘤抗体，这些抗体可以标记癌细胞以进行后续消除。7,8此外，TIBs 可以与肿瘤中的其他免疫细胞密切相互作用。9这种相互作用得到了观察结果的支持，即肿瘤中聚集的 B 细胞通常标志着各种免疫细胞类型的空间富集和三级淋巴结构 （TLS） 的形成，10它们作为 B 细胞成熟的区域枢纽发挥作用，并有助于增强抗肿瘤免疫反应。11此外，越来越多的证据表明 B 细胞是各种癌症类型的预后标志物，但癌症类型具有显着的异质性。12,13,14B 细胞与免疫治疗反应的关联进一步强调了 B 细胞的临床意义。15特别是，TLS 的存在已被确定为对癌症免疫治疗反应的强大预测生物标志物。16,17,18尽管这些发现强调了 B 细胞在抗肿瘤免疫中的重要作用，但它们的泛癌共享和癌症类型特异性特征，尤其是这些过程背后的潜在 B 细胞亚群，仍然知之甚少。

TIB 包含几个主要谱系，包括初始 B （Bn） 细胞、记忆 B （Bm） 细胞、生发中心 B （Bgc） 细胞和抗体分泌细胞 （ASC）。10,19单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq） 技术使 TIB 的精细表征成为可能，并且 TIB 的谱已开始出现。20,21例如，已确定 FCRL4 Bm 亚群与鼻咽癌 （NPC） 患者生存率的提高相关，+22,23并与非小细胞肺癌 （NSCLC） 的免疫治疗反应有关。24然而，目前尚不清楚某些癌症类型的此类发现是否具有普遍性。此外，每个数据集的测序 B 细胞数量不足可能会阻碍稀有亚群的检测。类似于泛癌性 T 和髓样细胞图谱的构建，2,3泛癌种 TIB 数据集的大规模整合有望为解决上述挑战提供前景。

在这项研究中，我们收集了 TME 已发表的广泛 scRNA-seq 数据集，并将它们与我们新生成的 scRNA-seq 数据相结合，以构建一个全面的人类 B 细胞图谱。我们还在计算机中重建了 B 细胞受体 （BCR） 库，并进行了免疫组化 （IHC） 染色以说明 TIBs 的空间分布模式。这样的资源能够系统地检查跨癌症类型之间 TIB 的转录、克隆和空间异质性。我们还发现了与预后相关的 TIB 亚群，特别是定义了可以与其他免疫成分密切交流以参与肿瘤相关免疫反应的 TIB 细胞。

①构建 B 细胞的泛癌种单细胞图谱

    我们新生成的泛癌 scRNA-seq 数据集与其他 54 项已发表的研究组合在一起，以阐明 TIBs 的泛癌特征（表 S1）。我们进行了严格的质量控制和过滤，然后通过每个数据集中的无监督聚类分别将 B 细胞与其他细胞类型区分开来，保留了高表达经典 B 细胞标记基因的聚类。然后编制了高质量的单细胞转录组图谱，其中包含来自 19 种主要癌症类型的 649 名患者的 948 个样本的 511,847 个 B 细胞，主要涵盖肿瘤组织、邻近非肿瘤组织 （ANT） 和外周血（图 1A 和 S1A;表 S1;STAR 方法）。此外，对于具有可用原始测序数据的 59,592 个细胞（图 1A），我们利用库序列调用工具 TRUST4 计算重建了它们的 BCR 序列。25此外，为了研究 TIB 的空间定位，我们对 80 个石蜡包埋的组织标本进行了多个 TIB 相关标记物的 IHC，这些标本涵盖 9 种癌症类型，具有 6 个不同的面板（图 1A 和 S1B;表 S2）

重建的 BCR 序列使我们能够检查 TIBs 的各种克隆型特征 （STAR 方法）。为了举例说明 BCR 库的实用性，我们根据 TIBs 的 Ig 常数区域确定了 TIBs 的 Ig 重链同种型，在 B 细胞主要谱系中发现了不同的同种型分布模式（图 1D）。Bn 簇以 IgM 和 IgD 同种型为主，ASC 簇显示 IgA 和 IgG 同种型的高度富集，而 Bm 和 Bgc 簇表现出各种同种型的混合物。然后，将量化为 Ig 可变区点突变率的每个细胞的体细胞超突变 （SHM） 水平分为三组：低 SHM （突变率 < 1%）、中位 SHM （1%–5%） 和高 SHM （> 5%）。我们在 Bn 细胞的 BCR 中观察到低水平的 SHM，在 Bm 细胞、Bgc 细胞和 ASCs 的 BCR 中观察到中等或高水平的 SHM（图 1D），对应于它们的进行成熟阶段，这种模式在不同癌症类型中一致观察到（图 S2B）。我们根据各自的中位 SHM 水平进一步将 Bgc 细胞、 Bm 细胞和 ASCs 分为两组，发现 B 细胞成熟标志物 CD27 在 SHM 高组中表现出较高的表达水平，而 IGHM 和 IGHD 在 SHM 低组中的表达较高（图 S2C）。

②不同癌症类型的 B 细胞异质性

泛癌图谱使我们能够系统地检查不同癌症类型之间 TIBs 的异质性。在肿瘤中，免疫隔室内 B 细胞的比例因癌症类型而异（图 2A），从葡萄膜黑色素瘤 （UM） 的接近 0% 到 NPC 的 29.5% 不等。有趣的是，对于肿瘤中含有大量 B 细胞的某些癌症类型，例如结直肠癌 （CRC）、胃腺癌 （STAD） 和食管癌 （ESCA），在其 ANT 中也检测到高 B 细胞患病率（图 S3A）。此外，在这些起源于粘膜组织的癌症类型中，观察到 ANT 和肿瘤之间 B 细胞群大小的正相关（图 2B），这反映出这些组织中炎症状态或 TLS 的存在可能导致观察到的 B 细胞水平较高。相比之下，在乳腺癌 （BRCA）、NSCLC 和胰腺癌 （PACA） 中，它们也以大量 B 细胞为特征，我们与 ANT 相比发现了肿瘤中 B 细胞丰度升高（图 S3B），这与之前基于 TCGA 批量 RNA-seq 数据的报告一致。13通过 ANT 和肿瘤标本的 IHC 染色也观察到这种变化（图 S3C）。鉴于即使在具有相同癌症类型的患者中 TIB 水平也存在差异（图 2A），我们假设 TME 特异性细胞间通讯也可能影响 B 细胞浸润。事实上，与肿瘤浸润性 T 细胞和髓样细胞相比，TIB 很少在泛癌水平上独立存在（图 2C;STAR 方法），扩展了以前在某些癌症类型的观察结果。16,35,36此外，基于 CellChat 的37分析显示，预计 TIB 会被其他细胞类型吸引而不是募集（图 S3D;STAR 方法）。在趋化因子途径中，据报道 CXCL12-CXCR4 轴介导 B 细胞的定位38以及 PC 在肿瘤中的播散，8在各种癌症类型中反复观察到（图 S3E）。因此，器官结构和 TME 相关因素都可以影响癌症类型依赖性 B 细胞浸润水平。

③人类肿瘤内生发中心反应的概括

我们的图谱还为分析稀有细胞类型提供了机会。以 Bgc 细胞为例，我们在 TME 中观察了它们的转录特征和转换动力学。传统上，次级淋巴器官 （SLO） 中的 B 细胞亲和成熟主要发生在生发中心，其中 Bgc 细胞在亮区和暗区之间循环，并迭代积累 BCR 突变，最终产生抗原特异性 Bm 细胞和 PC。

④鉴定与肿瘤免疫反应相关的潜在 B 细胞亚群

使用跨组织转录组学和 BCR 数据，我们接下来专注于从三个角度确定可能参与肿瘤相关免疫反应的关键 B 细胞亚群，包括肿瘤富集程度、克隆扩增和增殖。对 B 细胞亚群在不同组织中的分布分析显示，循环 B 细胞和组织浸润 B 细胞之间存在显著差异。

⑤FCRL4 和应激反应 Bm 细胞与患者预后相关+

值得注意的是，B 细胞亚群表现出癌症类型依赖性与患者预后相关。FCRL4 Bm 特征表达相对较高的患者在泛癌水平上往往表现出较长的生存期。然而，应注意癌症类型的异质性，因为在某些癌症中，例如头颈部鳞状细胞癌 （HNSC） 和结肠腺癌 （COAD），FCRL4 Bm 特征的预后略差。

⑥肿瘤相关 ABC 的活化表型

上述分析共同指出了 FCRL4 Bm 细胞在肿瘤中的关键作用。尽管丰度不同，但在我们分析的几乎所有癌症类型的肿瘤中都发现了 FCRL4 Bm 细胞。

⑦TAAB 与 CD4 T 细胞相互作用，可作为免疫治疗反应预测因子

⑧讨论

在这里，我们构建了人类 B 细胞的综合单细胞图谱，能够在泛癌水平上系统地描绘 TIBs 的种群景观，以及它们的空间分布模式、克隆状态和发育动态。TIBs 对某些癌症类型表现出明显的偏好，其丰度受器官结构和 TME 相关因素的影响。我们的图谱还能够识别肿瘤内 B 细胞分化阶段的关键过渡亚群，例如前 GC B 细胞和浆母细胞。特别是，我们证明了肿瘤内生发中心反应的发生类似于 SLOs，迭代 BCR 序列进化的过程以及 Bm 细胞和 ASCs 的起源概括了。这些观察结果强调了 TME 是一个动态生态系统，允许原位 B 细胞活化和分化。在我们的 BCR 分析中，两个人之间的 BCR 共享几乎无法检测到。LZ/DZ 样 Bgc 细胞的特征与泛癌水平的良好预后没有明显的关联。考虑到 Bgc 细胞很少见，通常仅存在于成熟 TLS 肿瘤的一部分中，因此对大量表达的贡献很小，因此通过 TCGA 批量数据中的计算策略量化它们的细微外观仍然具有挑战性。

TIB 主要作为肿瘤相关抗原呈递细胞和抗体产生者发挥作用，作为同源抗原驱动的免疫反应的先天性和适应性机制之间的纽带。19然而，对负责执行这些活动的特定 B 细胞亚群的研究关注有限。我们的 TIBs 细粒度转录组图谱允许对 TIB 表型进行子集水平的描述。特别是，我们确定富含肿瘤的 FCRL4 Bm 亚群是肿瘤相关免疫反应期间 TIB 参与抗原呈递的潜在贡献者。此外，在瘤内 PC 的同种型中，证明了对 IgG，尤其是 IgG1 的偏性，表明 TME 特异性刺激或选择压力可能会影响抗体库。以前的研究表明 PC 在不同情况下具有抗肿瘤和促肿瘤作用。我们观察到表达 IgG 受体的广谱巨噬细胞亚群，除了在指导抗肿瘤抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 （ADCC） 和抗体依赖性细胞吞噬作用 （ADCP） 方面的作用外，IgG 介导的巨噬细胞活化还可能与血管生成和免疫抑制或其他促肿瘤活性有关。+46同时，IgA 抗体还可以参与 T 细胞介导的癌症消除，承担抗肿瘤作用。97鉴于据报道 IgG 和 IgA PC 与其他免疫成分通信以协调不同癌症类型的抗肿瘤或促肿瘤活性，98,99对它们的预后关联的研究应进一步考虑肿瘤中多细胞模块的背景。值得注意的是，尽管我们确定了肿瘤中肿瘤相关 B 细胞免疫反应的证据，但我们的数据无法区分肿瘤特异性抗原的免疫反应。

两个 Bm 亚群 c08_ABC_FCRL4 和 c09_ABC_FGR 显示出与先前报道的 ABC 以及在不同免疫背景下（包括感染、自身免疫性疾病、疫苗接种和衰老）下可变称为双阴性、耗竭、组织样记忆和年龄相关 B 细胞的共享基因特征。27,28,29,100,101与富含血液的 c09 细胞相比，富含肿瘤的 FCRL4 Bm 细胞 （c08） 具有高克隆扩增水平和增殖能力，以及肿瘤内高度激活的转录状态，因此被命名为 TAABs。CR2 和 CD86 在 TAAB 中的表达模式让人想起之前报道的 CD21+低CD86 B 细胞在 CRC 中，可以呈递抗原以增强自体 CD3 T 细胞的 IFN γ分泌。++102此外，除了 CXCR5 的表达与其他 CD20 B 细胞亚群相似外，TAAB 还具有显著的高 CXCR3 表达，表明独特的趋化行为。鉴于 CXCR3 在 CD4 T 细胞中的广泛表达，+103我们假设 TAABs 和 CD4 T 细胞可能具有共同的迁移模式。

在泛癌水平的所有 B 细胞亚群中，TAAB 特征与良好预后表现出最强的相关性，但其预后意义存在上下文依赖性。我们的结果与之前的报道一致，即 FCRL4 B 细胞或 ABC 与 NSCLC 的良好生存率有关+24和 HCC104但 CRC 的结果较差。105有趣的是，在肾癌中，B 细胞与不良预后相关，13TAAB 特征可预测患者预后改善。值得注意的是，与其他癌症类型相比，大多数肾癌患者 TAAB 的存在有限（图 6A）可能会限制它们的有益影响。相反，在 NPC 中，在所有癌症类型中都具有相对较高的 TAAB 丰度，据报道 FCRL4 B 细胞具有阳性预后价值。+22,23此外，TAABs 可以作为对多种免疫治疗策略反应的预测因子。CXCL13CD4 T 细胞，已知可促进有效的适应性免疫，并作为人类癌症免疫治疗反应的生物标志物，+95,96似乎与 TAAB 通信。需要进一步的研究来探索如何将 TAABs 的抗肿瘤潜力用于临床实践。

在我们试图确定与不良患者结果相关的 TIB 亚群时，我们发现 Bregs 或至少 IL10 B 细胞在单细胞聚集分析中仍然难以捉摸，并且可能来自 B 细胞分化的各个阶段。这些观察结果与之前的观察结果一致，即在不同成熟和分化阶段的 B 细胞群中发现了 Breg 细胞，包括早期过渡 B 细胞，+49,106以及 Bm 细胞106和浆母细胞。107,108然而，在基于转录组的分析之外，应该进一步探索 Bregs 的作用。除 Bregs 外，具有应激表型的富含肿瘤的 B 细胞亚群似乎与不良预后相关。以前，我们和其他人发现，在肿瘤浸润的 T 细胞和 NK 细胞区室中，具有应激反应特征的细胞富集也与免疫治疗耐药性或生存率低有关。44,45我们假设在各种免疫细胞类型中观察到的这种应激状态可能是由 TME 内的共享线索诱导的。尽管c06_Bm_stress反应细胞没有表现出免疫抑制分子表达升高或活化标志物和抗原呈递相关基因表达降低，但发现它们下调 BCR 信号转导相关基因（图 1C）并与 CD4 T 细胞相互作用的潜力较低（图 S7C）。

在我们修订过程的最后阶段，一项新发表的研究还强调了 ABC 在人类癌症中的作用。109与他们将这些细胞视为一个同质群体不同，我们的分析将它们分为两个子簇，即 c08_ABC_FCRL4 和 c09_ABC_FGR。重要的是，只有 c08 在肿瘤中富集，而 c09 细胞主要存在于血液中。重新分析他们定义的 ABC 人群 （B09.DUSP4 + AtM）证实了类似的分为这两个子集（图 S7K）。这种粒度水平的差异可能是这两项研究之间观察到的差异的原因。虽然他们的研究声称肿瘤中的 ABC 来源于滤泡外反应，但我们的数据表明，不应排除可能源自生发中心的来源。c08 细胞的 SHM 率高于 Bgc 细胞，而 c09 细胞的 SHM 低于 Bgc 水平（图 1D）。此外，c08 细胞的 CSR 率明显高于 c09 细胞。鉴于生发中心作为 SHM 和 CSR 的主要站点的作用，50这些差异表明在这两个 ABC 亚群的开发过程中 GC 依赖性水平不同。ABC 是否具有生发中心起源110,111或源自卵泡外反应112,113仍未解决，需要进一步调查。

总而言之，我们的研究从泛癌的角度提高了目前对 B 细胞的理解，阐明了 B 细胞的异质性及其抗肿瘤免疫反应。我们希望我们的大规模数据可以进一步推动 B 细胞相关免疫疗法的发展。

文献：Pan-cancer single-cell dissection reveals phenotypically distinct B cell subtypes - PubMed (nih.gov)