分析方法升级&三代测序辅助,优化无参转录组测序策略

分析方法升级&三代测序辅助,优化无参转录组测序策略

无参转录组拼接升级
Corset 让“基因”概念更准确

在无参转录组项目中,利用主流软件 Trinity 进行 De novo 拼接转录本,
而后选取最长的转录本作为 unigene 进行后续分析。
但是研究表明,完全以 unigene 作为基因的替身,有失恰当。
因为,拼接出来的最长转录本会掩盖掉本应真实的较短转录本(基因的 isoform)所具备的参考序列意义。
Corset 是 Trinity 官方推荐软件,可对拼接得到的转录本进行过滤和聚类,
获得更接近真实的“gene”,突破了传统“unigene”概念。

Corset 应用优势

Corset 应用案例

ATP5J 和 GABPA 两个基因有一段重叠的部分,当使用无参拼接时,会得到8条转录本,其中3条最长的转录本为拼接引起的假阳性转录本(如 Cluster b 中的转录本)。若使用 unigene 的方法,根据 unigene 最长转录本原则,会选取假阳性转录本进行后续分析,这并不准确。而使用 Corset 聚合“Gene”的方法,可以将这些真实的转录本分离出来(如 Cluster a 和 Cluster d)。

图1 Trinity拼接基因 ATP5J 和 GABPA 的转录本

三代联合二代
实现全长转录本定量分析

第三代单分子测序技术可以直接获得全长转录本信息,
省去了转录本拼接过程,获得无冗余转录本集合,
但是,无法获得转录本的表达丰度信息。
三代测序结合二代测序,可获得精确的全长转录本序列,
并可进行转录本定量分析和功能分析,为无参转录组研究提供完美保障!

三代联合二代技术参数

分析内容三代测序二代测序
样本要求

样品类型:total RNA
样品总量:≥10ug
RIN:≥8

样品类型:total RNA
样品总量:≥1ug
RIN:≥6.3(植物)6.5(动物)

文库类型

cDNA 文库
(1-2K、2-3K、3-6K)

cDNA 文库
(250-300bp 插入片段)

测序平台

PacBio RSⅡ

Illumina HiSeq

数据量

推荐8个 SMRT cell/sample
(约6G 数据量)

6G、8G、10G/sample

三代联合二代应用优势

参考文献

[1] Davidson, N.M. and A. Oshlack, Corset: enabling differential gene expression analysis for de novo assembled transcriptomes. Genome Biol, 2014. 15(7): p. 410. 阅读原文 >>

[2] Xu Z, Peters R, Weirather J. Full‐length transcriptome sequences and splice variants obtained by a combination of sequencing platforms applied to different root tissues of Salvia miltiorrhiza and tanshinone biosynthesis[J]. Plant Journal, 2015, 82(6): 951-961. 阅读原文 >>

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