国自然热点 | CUT&Tag解析组蛋白乳酸化H3K18la修饰在小鼠和人组织中的全基因组分布特征

此前，在推文《组蛋白ChIP-seq研究思路及应用案例分享》中我们分享了组蛋白ChIP-seq的一些研究思路。文章中提到了几种新型组蛋白修饰：丙酰化、丁酰化、琥珀酰化、丙二酰化、戊二酰化、巴豆酰化和乳酸化等，其中组蛋白乳酸化修饰是2019年新发现的，一经发表就登上了Nature[1]，该研究将细胞代谢与表观遗传调控联系起来了。

 Warburg 效应|Matthew G. Vander Heiden et al. Science. 2009

提到乳酸，就不得不提Warburg 效应（有氧糖酵解），它是癌症的标志之一。在有氧条件下，癌细胞倾向于将葡萄糖转化成乳酸来产生能量，与正常细胞相比，葡萄糖代谢的乳酸更多。因此，肿瘤中的组蛋白乳酸化很可能是异常的。另外，组织中微环境的乳酸水平升高是慢性炎症的一个众所周知的特征。因此，乳酸既是能量底物，又是信号分子。

 Li, X., Yang, Y., Zhang, B. et al.Lactate metabolism in human health and disease. Sig Transduct Target Ther 7, 372 (2022).

乳酸参与调控肿瘤、心血管系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统等疾病，乳酸在疾病的临床诊断和预后中起着重要的作用[2]。组蛋白乳酸化修饰发现时间短，乳酸又参与调控不少生物学功能。所以，组蛋白乳酸化修饰可以说处在高分文章的红利期，同时它也是今年的国自然热点。

研究组蛋白乳酸化修饰可以考虑ChIP-seq和CUT&Tag技术，爱基百客在这两个产品上都有丰富的项目经验，尤其是王牌产品ChIP-seq（常规修饰甲基化、乙酰化及非常规修饰巴豆酰化等，可以关注往期的项目文章解读）。

本期和大家分享一篇研究组蛋白乳酸化H3K18la修饰的文献，帮大家了解下组蛋白乳酸化修饰的研究思路。

发表期刊：Genome Biol

影响因子：17.906

研究技术：CUT&Tag

2022年10月瑞士苏黎世联邦理工学院营养和代谢表观遗传学实验室团队在Genome Biology(IF: 17.906)期刊发表题为“H3K18 lactylation marks tissue-specifc active enhancers”的研究论文。该研究在小鼠和人的多个组织或细胞中检测了H3K18la全基因组分布，并将其与其他研究的较为成熟的组蛋白修饰进行比较分析，结果发现H3K18la不仅可以标记活性启动子，还可以标记组织特异的活性增强子。

研究背景

在人类、小鼠、植物、真菌和寄生虫样本中已经报道了超过30个组蛋白乳酸化位点。H3组蛋白18位的赖氨酸残基的乳酸化已经进行了一些深入研究，研究显示其在基因启动子上高度富集，并与癌细胞和巨噬细胞中的相关基因的活跃表达有关。但迄今为止，大多数的Kla的报道集中在总Kla水平的变化，但全基因组H3K18la分布及其与其他组蛋白修饰和基因表达的关系报道较少。

该研究发现H3K18la存在于人和小鼠大范围不同代谢状态的细胞类型和组织中。此外，H3K18la不仅富集在启动子上，还富集于组织特异的活性增强子上；并且类似于但不是拷贝H3K27ac修饰的基因组定位。

研究方法

CUT&Tag（爱基百客可提供）

研究思路

 研究结果

1. 组蛋白乳酸化存在于多种代谢状态的组织中

为了探索H3K18la的作用，作者调查了一系列体内和体外样本的H3K18la全基因组分布。因为组蛋白乳酸化与糖酵解活性和乳酸水平有关，作者选择了发育阶段和有丝分裂活性不同的样品，并且这些样品的代谢范围很广，细胞内乳酸水平不同。

所选择的细胞和组织有：mESC-ser（Primed小鼠胚胎干细胞）、mESC-2i（Naïve小鼠胚胎干细胞）、MB（成肌细胞）、MT（肌管细胞）、GAS（小鼠肌肉样本，腓肠肌）、ADIPO（脂肪组织）、BMDM（骨髓源性巨噬细胞）和PIM（缺血后巨噬细胞）。Western blotting结果显示H3K18乳酸化存在所有细胞和组织中（图1A）。

 图1A 各个样本的Western blotting结果

2. H3K18la标记活性启动子

为了研究H3K18a的功能，作者构建了H3K18la、H3K4me3和/或H3K27ac（活跃翻译后修饰标记）和H3K27me3（抑制翻译后修饰标记）的CUT&Tag测序文库，用来表征它们的基因组定位。首先，作者在全局范围比较了这些数据集。采用了多维尺度分析（MDS分析），基于标记类型（活跃vs抑制），根据样品来源以及特异的翻译后修饰，这些样品聚集成簇（图1B）。MB、MT和GAS活性标记以及BMDM和PIM数据集聚集在一起（图1B）。对于每种细胞类型，H3K18la样本聚集得更接近H3K27ac，而不是H3K4me3样本。这强调了H3K18la的基因组分布具有组织特异性，类似于来自同一组织类型的H3K27ac。值得注意的是，H3K18la ADIPO样本聚集在接近肌肉样本，尽管它们有明显的代谢率差异。尽管mESC-2i和mESC-ser或MB和MT之间的代谢状态存在差异，但它们的H3K18la图谱也基于其起源聚集在一起。这些结果表明，发育特性对H3K18la基因组分布具有重要意义。

另外，作者使用“SEACR peak caller”来定义组蛋白翻译后修饰（hPTMs）。定量H3K18la peaks的相关性分析结果表明mESC H3K18la特征与分化的细胞类型差异最大（图1C）。与赵英明课题组此前报道的结果一致，作者发现许多H3K18la峰定位于转录起始位点（TSS）附近，并与基因启动子或内含子重叠（图1D）。mESC和ADIPO的H3K18a 峰落在启动子区域的占比最高（~40%）（图1D）。ADIPO、GAS、PIM、MB和MT的H3K18la峰分布在TSS下游略有偏移，相应的H3K4me3/H3K27ac活性标记也是如此，但（抑制性）H3K27me3峰则没有。

基因组特征尺寸校正富集分析显示H3K18la信号在CpG岛（CGI）启动子中明显富集，而在非CGI启动子中没有富集（图1E）。为了研究启动子能否被不同组合的活性组蛋白翻译后修饰标记，作者将H3K4me3、H3K27ac和/或H3K18la 峰标记的启动子重叠（图1F）。作者发现，这些“活性”启动子中的绝大多数要么由H3K4me3+H3K27ac+H3K18la标记（37-50%），要么由H3K4me3+H3K27ac标记（19-21%），要么由H3K4me3单独标记（15-24%）。因此，只有大约一半的H3K4me3标记的启动子也被H3K18la标记。

为了研究H3K18la标记的活性启动子与非H3K18la标记的活性启动子之间是否存在功能差异，作者还观察了基因表达、基因本体（GO）富集及其相关基因的TF结合位点富集。综合这些结果，作者发现H3K18la富集于一个活性基因启动子（主要是CGI）的子集中，而H3K18la启动子水平与基因表达和公认的活性标记H3K4me3和H3K27ac呈正相关。

 图1 H3K18la标记活性的CGI启动子

3. H3K18la标记活性启动子

在上面的研究中，作者发现H3K18la 峰在TSS附近明显富集，但是也有一部分落到了TSS的远端（>2kb），并且它与启动子不重叠，而是定位于内含子和基因间区域。此外，与其他组蛋白修饰的全基因组定位比较分析中发现H3K18la与H3K27ac相似，而H3K27ac既可以标记启动子，也标记增强子。于是，作者他们推测H3K18la是否能标记增强子。

该研究主要从三个方面去验证这一推测。第一，构建了无监督的 ChromHMM分析，然后计算了ChromHMM状态富集在数据库ENCODE的情况。第二，将公共ChIP-seq数据集与该研究的数据集进行比较分析，发现CUT&Tag的数据与它们匹配良好。H3K18la数据与公共组织特异的ChIP-seq数据重叠支持了H3K18la标记组织特异的活性增强子。第三，作者分析了文献报道的公认增强子信息，计算出这些增强子中的哪一部分与H3K18la峰重叠。在7个被调查的组织中，有5个（未被发表的MB和ADIPO增强子），超过60%的已发表的组织特异性增强子被研究的组织对应的H3K18la峰覆盖。

另外，作者发现大量假定的dELS（远端增强子）仅由H3K18la峰标记，而没有由H3K27ac峰（或H3K4me3）标记，这表明在dELS中H3K18la还有额外的特异性作用。随后，作者分析H3K18la 标记的增强子是否与靶基因高表达有关。相关性分析发现远端增强子上H3K18la水平和靶基因表达的相关性弱，但正相关且显著的。

 图2 H3K18la标记组织特异的活性增强子

4. H3K18la的动态变化影响转录适应

然后，作者重点研究了密切相关的细胞类型之间H3K18la的功能相关变化，并比较了MT与MB和mESC-ser与mESC-2i。作者观察了MT和MB两种细胞基因组特征的H3K18la的变化。两种细胞状态间，很多启动子失去或者获得H3K18la的修饰；这些变化与相关基因的上下调呈正相关。以Myh1基因为例，Myh1基因的表达在MT中通过Myhas的激活和高乳酸化来调控。

在增强子方面，与作者之前的观察一致，增强子（dELS）乳酸化比任何其他基因组区域的H3K18la的变化更动态。而dELS中H3K18la的变化也与最近基因的基因表达的变化呈正相关。对MT vs MB或mESC-ser vs mESC-2i中，H3K18la变化显著的最接近dELS的基因进行GO分析, 结果发现GO term与各自的细胞类型有关。对MB- 和MT-特异增强子的进一步细节分析，支持作者的推测：启动子和增强子的定量乳酸化变化可以再现，甚至可能促进细胞状态的转变。总的来说，作者的数据表明，乳酸可能是一种细胞状态的过渡，通过基因启动子和增强子的高乳酸化来刺激代谢产物。

 图3 H3K18la影响转录适应的动态变化

5. H3K18la在人肌肉中是保守的，且标记活性启动子和增强子

作者为了确认他们的发现是否在人组织中保守，分析了两个人受试者股外侧肌表观基因组，并评估了H3K18la、H3K27ac、H3K4me3、H3K27me3和H3K9me3。根据MDS分析，H3K18la的特征与H3K27ac和H3K4me3的相关性最好（图4A）。H3K18la的peaks在基因组特征的分布与小鼠肌肉样本的结果非常相似，H3K18la 在启动子、内含子和基因间区富集（图4B），并且相当一部分peaks位于距离TSS>10kb区域。H3K18la峰在CGI启动子中强烈富集，而在非CGI启动子中则较少富集（图4C）。大部分H3K18la标记的启动子也被H3K27ac和H3K4me3标记（图4D）。作者发现启动子上的H3K18la水平与来自同一肌肉的公共基因表达数据的相关性相当弱（尽管是正相关），尤其在与H3K4me3或H3K27ac比较时。

然后，对那些启动子H3K18la水平最高的前2000个基因进行GO分析，结果显示H3K18la标记了对肌肉生物学重要的基因的启动子，基因启动子上有活性组蛋白标记（H3K27ac和/或H3K4me3）而没有H3K18la的在肌肉生物学项目上没有富集。此外，远端增强子H3K18la水平与基因表达呈正相关，但总体上较弱。

 图4人肌肉中的H3K18la标记着活性启动子和增强子

研究结论

该研究生成了小鼠和人组织的H3K18la分布的全基因组数据集，其中这些组织覆盖到许多代谢状态。监督（与公共数据重叠）和无监督（ChromHMM）分析反映H3K18la除了活性启动子，还标记组织特异的活性增强子。研究中还有一个兴奋的发现，活性CGI启动子上的H3Kla可能主要标记启动子嵌入的增强子序列，使得H3K18la成为与H3K27ac部分不同的组蛋白翻译后修饰的增强子标记。

文献链接：doi: 10.1186/s13059-022-02775-y

文献资料

1. Zhang, D., Tang, Z., Huang, H. et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature 574, 575–580 (2019). https://doi.org/10.1038/s41586-019-1678-1

2. Li, X., Yang, Y., Zhang, B. et al.Lactate metabolism in human health and disease. Sig Transduct Target Ther 7, 372 (2022).

◆  CUT&Tag产品介绍 ◆ 

CUT&Tag是蛋白质和DNA互作新兴的实验方法，该方法是通过蛋白特异性抗体引导Protein A-Tn5酶在目标蛋白结合的DNA位置进行切割并且在序列两端加测序接头，经过PCR扩增后形成可以用于高通量测序的文库，随后对文库进行测序分析从而解析与目标蛋白结合的DNA片段。

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