生信软件28 - fastq与bam的reads数量计算与双端fastq配对检测工具fastq-pair

基础软件安装

# 安装fastq-pair
conda install -c bioconda fastq-pair -y
conda install bedtools -y
conda install samtools -y

对双端fastq验证是否全部配对,计算fastq raw reads数量和基于bam文件计算指定区域的reads数量。

1. fastq-pair简介

验证fastq是否配对,并重写配对末端fastq文件,以确保所有reads都有一个配对的read1和read2,并分离出单端reads。

2. fastq-pair基本用法

# 输入2个配对的fastq文件
fastq_pair sample.R1.fastq sample.R2.fastq

# 生成4个文件,如果完全配对则2个single文件大小为0
# sample.R1.paired.fastq
# sample.R1.single.fastq
# sample.R2.paired.fastq
# sample.R2.single.fastq

fastq_pair 用法

3. bash计算fastq文件的reads数量和碱基数

######## 计算reads数量 ########
echo "`cat sample.fq|wc -l` / (4*1000000)"|bc -l

# 2.691563(单位M)


########  计算碱基数 ########
cat sample.fq| awk '{if(FNR%4==0) base+=length}END{print base/10^9, "G"}'

# 0.13727 G

其中bc -l 是Linux中的计算命令,相当于计算器对echo输出的公式进行计算。

4. bash计算fastq.gz文件reads数量和碱基数

######## 计算reads数量 ########
echo "`zcat sample.fq|wc -l` / (4*1000000)"|bc -l

# 2.691563(单位M)


########  计算碱基数 ########
zcat sample.fq| awk '{if(FNR%4==0) base+=length}END{print base/10^9, "G"}'

# 0.13727 G

5. bash批量统计fastq raw reads数量

# 遍历当前全部.fq文件,对全部.fq文件进行reads统计
ls *fq|while read fastq; do
	echo 
	fastq_reads=$(echo "`cat ${fastq}|wc -l` / (4)"|bc -l|cut -d '.' -f1)
	echo "$fastq: $fastq_reads"
	
	# 结果追加至fastq.statistic文件
	echo "$fastq    $fastq_reads" >> fastq.statistic

done

6. 指定区域reads数量提取

根据BAM文件指定区域(bed文件)的reads数量进行统计。

# 统计bam文件全部reads数量
samtools view -c sample.sorted.bam > sample.count

# 根据bed文件坐标统计指定区域的reads数控
bedtools multicov -bams sample.sorted.bam -bed chr1.bed > chr1.bed.count

# chr1.bed, \t分割
# 染色体名称 开始坐标  结束坐标
# chr1	1000000	1000100
# chr1	2000000	2000200

# chr1.bed.count结果
# chr1	1000000	1000100	4
# chr1	2000000	2000200	0

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<think>好的,我现在需要帮助用户了解ChIP-seq的息学分析流程。用户已经提供了一些参考引用,里面提到了几个关键步骤和工具,比如比对到参考基因组、峰值调用,以及使用的工具如FastQC、Bowtie2、MACS2等。首先,我应该先回忆一下ChIP-seq的标准流程,然后结合用户提供的引用内容,整理出一个清晰的步骤说明。 首先,用户给的三个引用中,引用[1]详细列出了处理SRR14879780数据的步骤,包括环境准备、质量控制、比对、峰值调用和基序分析。引用[2]提到了ENCODE的标准流程,可能涉及数据标准和处理的不同阶段。引用[3]则讨论了数据可视化工具的选择,如IGV和UCSC Genome Browser。我需要将这些息整合成一个连贯的流程。 接下来,我需要确定回答的结构是否清晰。通常,ChIP-seq流程包括数据质控、预处理、比对、后处理、峰值检测、注释富集分析、可视化、基序分析等步骤。用户的问题是关于步骤和方法的,所以每个步骤需要简要说明使用的工具和方法,并适当引用提供的资料。 需要注意的是,用户提到必须使用中文回答,并且行内数学公式用$...$,独立公式用$$...$$。不过ChIP-seq分析流程可能较少涉及数学公式,但如果有相关统计方法,可能需要提到,比如峰值调用中的统计模型。例如,MACS2使用泊松分布或负二项分布来识别显著富集区域,这时候可能需要公式。 另外,用户要求成相关问题,我需要根据回答内容提出几个相关问题,比如各个步骤的详细方法、工具比较、数据标准等。 现在需要检查是否有遗漏的步骤。引用[1]中的步骤包括准备环境、质量控制、去接头、比对、过滤排序、峰值调用、基序分析。引用[3]补充了可视化的部分。可能还需要数据下载和预处理,比如使用SRA Toolkit下载数据,但用户提供的引用中没有提到,可能需要假设用户已有数据。或者根据引用[1]中的步骤1,准备环境可能包括软件安装和数据准备。 另外,是否需要解释每个工具的作用?比如FastQC用于质控,Trim Galore用于去接头和裁剪,Bowtie2用于比对,samtools处理SAM/BAM文件,MACS2用于峰值检测,MEME-ChIP用于基序分析。这些都需要在步骤中说明。 在回答时,需要按照逻辑顺序排列步骤,并引用对应的引用文献。例如,引用[1]中的步骤1到7,引用[3]中的可视化部分。同时,确保每个步骤的说明简洁明了,避免过于技术化,但足够详细让用户理解流程。 最后,成相关问题需要考虑用户可能的后续疑问,比如各个步骤的详细参数设置、工具的比较(如为什么用Bowtie2而不用其他比对工具)、数据质控的标准、峰值调用的算法差异、可视化工具的选择等。 需要确保回答中没有错误,比如工具的正确使用顺序,以及引用对应的部分。例如,MACS2用于峰值调用是引用[1]提到的,而可视化部分引用[3]。同时,注意格式要求,如行内代码用反引号,步骤分点列出,使用中文等。 总结,回答的结构应该是: 1. 数据质控(FastQC) 2. 数据预处理(Trim Galore) 3. 序列比对(Bowtie2) 4. 后处理(samtools) 5. 峰值检测(MACS2) 6. 注释富集分析 7. 可视化(IGV, UCSC) 8. 基序分析(MEME-ChIP) 9. 高级分析(可选) 每个步骤简要说明工具和目的,并添加引用。然后列出相关问题,如性能分析、工具选择、参数优化等。</think>### ChIP-seq息学分析流程 ChIP-seq(染色质免疫沉淀测序)分析流程通常包含以下步骤,结合ENCODE标准及常用方法[^1][^2][^3]: --- #### **1. 数据质量控制** 使用`FastQC`评估原始测序数据质量,检查测序错误率、GC含量、重复序列等指标。低质量数据会导致后续分析误差,需特别关注Per base sequence quality和Adapter contamination模块。 ```bash fastqc SRR14879780_1.fastq SRR14879780_2.fastq ``` --- #### **2. 数据预处理** 通过`Trim Galore`自动去除接头序列并裁剪低质量碱基(通常质量值阈值设为$Q \geq 20$),处理后的数据保存为`.trimmed.fastq`: ```bash trim_galore --paired --quality 20 SRR14879780_1.fastq SRR14879780_2.fastq ``` --- #### **3. 序列比对** 使用`Bowtie2`将reads比对到参考基因组(如hg38),成SAM/BAM文件。比对率需满足ENCODE标准(通常>70%): ```bash bowtie2 -x hg38 -1 SRR14879780_1.trimmed.fastq -2 SRR14879780_2.trimmed.fastq -S aligned.sam ``` --- #### **4. 比对后处理** 利用`samtools`过滤低质量比对结果(如MAPQ < 30)并排序: ```bash samtools view -@ 8 -bS -q 30 aligned.sam | samtools sort -@ 8 -o sorted.bam ``` --- #### **5. 峰值检测** 使用`MACS2`识别显著富集区域。其核心算法基于局部泊松分布: $$ \lambda_{local} = \max(\lambda_{BG}, \lambda_{1kb} \times \frac{L}{1kb}) $$ 其中$\lambda_{BG}$为全局背景噪声,$L$为峰宽[^1]。 ```bash macs2 callpeak -t sorted.bam -c control.bam -f BAM -g hs -n output --broad ``` --- #### **6. 注释富集分析** 通过`HOMER`或`ChIPseeker`对峰值进行基因注释,结合`DAVID`或`GREAT`分析功能富集。 --- #### **7. 可视化** - **IGV**:查看特定基因位点的reads分布(如TP53基因区域)[^3]。 - **UCSC Genome Browser**:成可共享的基因组轨迹图。 --- #### **8. 基序分析** 使用`MEME-ChIP`预测转录因子结合基序,典型输出包括位置权重矩阵: $$ PWM_{i,j} = \log_2 \frac{p_{i,j}}{b_j} $$ 其中$p_{i,j}$为碱基$j$在位置$i$的频率,$b_j$为背景频率。 --- #### **9. 高级分析(可选)** - 差异结合分析(如`DiffBind`) - ATAC-seq或RNA-seq数据整合 ---
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