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公司英文名称：Kyoho Gene Technology (Beijing) Co.,Ltd.这期分享一篇2023年7月份发表在 Clin Transl Med (IF:10.6)，作者基于scRNA-seq研究B细胞异质性和三级淋巴结构预测乳腺癌预后和新辅助治疗效果。该文章使用桓峰基因公众号里面生信分享教程即可实现，有需要类似思路的老师可以联系我们！
摘 要
背景: 乳腺癌(BC)是一种高度异质性的疾病。尽管免疫疗法最近提高了许多实体和血液恶性肿瘤患者的生存率，但大多数BC亚型反应不佳。免疫检查点阻断疗法(ICB)，B细胞尤其是那些聚集在三级淋巴结构(TLS)中，在抗肿瘤免疫中起重要作用。然而，单细胞分辨率下的B细胞异质性及其TLS在BC中的临床意义有待进一步探讨。
方法: 对原发肿瘤病变及周围正常组织进行观察取自14例BC患者，共计124,587个细胞，用于单细胞转录组测序和生物信息学分析。
结果: 在常规标记的基础上，单细胞转录组谱得到分为不同的cluster。单细胞研究重点关注肿瘤浸润性B细胞(TIL-B)和肿瘤相关中性粒细胞。TIL-B被分为五个簇，和不寻常的细胞类型，如B细胞与免疫治疗效果密切相关识别。在BC中，TAN与TIL-B浸润呈正相关，同时，与tls -高组相比，tls -低组的TAN与TIL-B呈负相关显著正相关。
结论: 总之，我们的研究强调了B细胞的异质性BC，解释了B细胞和TLS如何在单细胞和临床水平上显著促进抗肿瘤免疫，并提供了一个直接的标记用于TLS，称为CD23。这些结果将提供更多有关的信息肿瘤免疫治疗BC的适用性和有效性。
生信分析流程
相关数据集选择：
scRNA-seq 数据（10 IDC and 4 DCIS）
BC cohorts (GSE7390, GSE58812)
TCGA-BRCA cohorts (1108 samples from individuals)
70 cases of BC tissue specimens
GSE35640; GSE25055; IMvigor210
基因集选择：
单细胞分析结果找到的Marker
生信分析方法：
我们从文章的分析流程中提取所有的分析内容，整理出来就 18个分析条目，每个条目都包括分析的内容，这些分析构成了整个文章，本文属于单细胞测序生信分析和临床预测模型以及实验验证相结合的文章，下面我们就看看哪些分析可以利用桓峰基因公众号的教程来实现，点击分析条码就会跳转到对应公众号的教程，跟着教程做，您也能发轻松发高分，如下：
3. 去除双细胞（DoubletFinder)
4. 标记基因GO富集分析 （ClusterProfiler)
6. 伪时间轨迹分析用来推断TIL-B的发展（Monocle 2）
9. FCER2 (CD23)在不同类型肿瘤和非肿瘤组织中的表达（TIMER2）
13. 研究BC免疫细胞的单细胞代谢特性（scMetabolism）
15. TCGA-BRCA 数据DEGs分析（Deseq2）
16. TAN和TIL-B在BC中的相关性（cBioportal）
17. 基于scRNA-seq的细胞浸润类型表征（CIBERSORTx）
18. 每个B细胞亚群DEGs的单样本免疫浸润分析（ssGSEA）
研究结果
1. 单细胞转录组数据整合识别乳腺癌(BC)的肿瘤微环境(TME)。
(A)工作流程图给出了收集和准备用于scRNA-seq分析的样品所涉及的程序的总体概述。
(B)参加试验的乳腺癌患者的临床数据。
(C)在本研究中，scRNA-seq数据的细胞类型使用均匀流形近似和投影(UMAP)投影显示(124 587个细胞;14例)。
(D)乳腺癌样本中每种细胞的百分比。
(E)每个乳腺癌样本中主要细胞类型的分布。
(F)特征图上显示了典型的典型标记基因及其在每个簇中的统一表达水平。
2. 乳腺癌(BC)中B细胞浸润性肿瘤。
(A)在目前的研究中，来自乳腺癌患者有5个显著的B细胞亚群。
(B) B细胞亚群对应的独特基因显示在热图。
(C) 14例BC患者样本中B细胞簇的分布。
(D) B细胞亚群中的GO富集途径为在点图中显示。
(E) 基于B细胞热图显示的scRNA-seq数据，利用单样本GSEA (ssGSEA)
确定每个cluster的细胞标识。
(F) 生成高CD69和低CD69两组BC患者的生存曲线使用GEPIA进行表达组。
(G)cluster3中IGHG1、IGHA1、IGLC3和IGKC的表达(等离子体)用均匀流形近似和投影(UMAP)投影表示。
3. 乳腺癌中TIL-B的发展过程分析。
(A和B)在单片片2的伪时间轨迹图中描绘了TIL-B亚群的伪时间曲线(A)及其发展轨迹(B)。通过Monocle 2推测TIBs各亚群的发育途径及分化机制。
(C)红色和绿色箭头表示细胞发育的两条虚拟时间路径。这条轨道在灰色区域表示的岔路点之前开始。
(D) TIB各亚群高表达匹配基因的伪时间变化曲线。
(E) 反映估计的伪时间轨迹的DEGs被分为6个子簇，并对每个子簇进行GO富集分析。
4. TIL-B与成熟三级淋巴结构(TLS)的相关性分析。
(A)在TCGA研究联盟BRCA数据集中的200例患者中，鉴定出18例表现出TLS阳性的患者。这些患者特征性TLS的H&E图像。
(B)从我们收集的70个BC样本中获得了描述CD23阳性TLS中CD23和CD21共定位的共免疫荧光亚图。
(C)在70例BC患者中9例tls阳性患者中，tls阳性BC患者CD4、CD8、CD20、CD23、BCL6表达的H&E染色和IHC染色的代表性图像。
(D) 200例tls阴性和tls阳性TCGA BRCA病例的DEGs分析。
(E和F) 70例典型tls阳性BC患者的H&E (E)和CD23 IHC (F)图像。
(G)根据TIMER2，不同肿瘤类型表现出FCER2的表达。
(H)利用TIMER2中的EPIC和TIDE算法，计算BC中FCER2表达与肿瘤浸润免疫细胞的关系。
(I-J) FCER2的Kaplan-Meier生存曲线(I)， TIMER2在BC中与FCER2和B细胞(J)共同作用。TIL-B，肿瘤浸润性B细胞。
5. 肿瘤微环境之间的细胞通讯网络。
(A) Circos图，利用CellphoneDB，阐明了成纤维细胞和多种免疫细胞类型中配体和受体之间的相互作用。分析的重点是9例乳腺癌(BC)患者的三级淋巴样结构(TLS)阴性(左)和TLS阳性(右)队列。
(B) Dotplot提供了tls阴性(左)和tls阳性(右)微环境中特定配体-受体对之间复杂相互作用的可视化表示，涉及成纤维细胞和免疫细胞。这项分析是使用CellphoneDB进行的。
(C)圆形图描绘了在tls阴性(左)和tls阳性(右)条件下成纤维细胞和免疫亚群之间的相互作用权重。
(D)整体信号通路强度对比柱状图
(E)涉及成纤维细胞和免疫亚群的tls阳性和tls阴性相互作用数量差异的热图。这些图表是使用CellChat生成的。
6. 中性粒细胞在乳腺癌(BC)中的灵活性被单细胞测序证实。
(A)柱状图比较了使用CellChat数据的9例BC患者信号通路的总体强度。结果表明，三级淋巴结构(TLS)阳性的情况下有一条突出的黄色信号通路，而TLS阴性的情况下则有一条突出的绿色信号通路。
(B)散点图描述了BC队列(GSE7390)中肿瘤相关中性粒细胞(TAN)与TIL-B浸润之间的关系。
(C和D)散点图描述了BC队列(GSE7390)中TAN和TIL-B浸润之间的关系，分别为TLS高(C)和TLS低(D)。
(E)目前正在研究的来自BC患者的10445个中性粒细胞的均匀流形近似和投影(UMAP)投影，显示了6个主要的中性粒细胞亚群。
(F和G) 9例BC患者的中性粒细胞亚群;由TLS-Positive (F)和TLS-Negative (G)组成，通过柱状图描述了其主要KEGG通路的丰富结果。
(H)散点图描绘了三阴性BC (TNBC)队列(GSE58812)中TAN与TIL-B浸润的关系。
(I) Kaplan-Meier曲线显示，在TNBC队列(GSE58812)中，B细胞浸润增加的患者有更高的OS。
(J) Kaplan-Meier曲线显示，在TNBC队列中，中性粒细胞浸润显著的患者生存机会较差(GSE58812)。
7. 乳腺癌(BC)中不同的三级淋巴结构(TLS)状态显示出代谢变异性和生存差异。
(A)柱状图描绘了9例BC患者中浸润肿瘤的免疫细胞在tls阳性组和tls阴性组的分布。
(B) 9例BC患者tls阳性组和tls阴性组免疫细胞差异的遗传分析。
(C) 9例BC患者tls阳性组和tls阴性组代谢途径评分热图。
(D)热图显示9例BC患者中tls阳性组和tls阴性组的平均代谢基因表达。
(E)为了确定CD23与生物标志物柠檬酸合成酶(CS)、HK2、乳酸脱氢酶A (LDHA)和IDH3G在BC中的表达相关性，利用cBioportal工具。
(F) Kaplan-Meier生存曲线，通过GEPIA分析APOD高表达和低表达队列之间BC结局的差异。
(G) tls阳性患者新辅助化疗前后影像学表现，效果显著。
(H) tls阳性患者新辅助免疫治疗前后显像，效果显著。
8. 三级淋巴样结构(TLS)和TLS特异性标志物对乳腺癌预后的潜在意义与健康评分匹配(PSM)匹配后，进行生存分析和预后因素分析。
对于生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank检验。预后因素采用COX比例风险回归模型。
(A)无病生存(DFS)(左)和OS的Kaplan-Meier生存曲线(右)920例TCGA BRCA患者的单基因表达(CD20, CD23和CD8)。
(B) CD20、CD23、CD8、CD4和BCL6对920例TCGA BRCA患者预后的影响森林图显示HR和95%置信区间，并对分子分型、淋巴结状态、肿瘤大小、诊断年龄等因素进行了PSM匹配以及BC的组织学分级。
(C)基于TLS表达的70例BC患者DFS的Kaplan-Meier生存曲线。
Reference:
1. Wang Q, Sun K, Liu R, et al. Single-cell transcriptome sequencing of B-cell heterogeneity and tertiary lymphoid structure predicts breast cancer prognosis and neoadjuvant therapy efficacy. Clin Transl Med. 2023;13(8):e1346. doi:10.1002/ctm2.1346
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文献解读
IF：12+ 不同癌症中TMB与ICI反应之间的免疫相关因素研究
IF：4+ 铁代谢和免疫相关基因标记预测三阴性乳腺癌的临床结局和分子特征
IF：14+ “冒烟型”骨髓瘤的分子组成突显了导致多发性骨髓瘤的进化途径
IF：5+ 7种癌症免疫治疗证明DNA损伤反应通路突变可作为免疫检查点封锁疗效的潜在生物标志物
IF：11+ 研究CpG岛甲基化表型病因和致癌转化的泛癌综合分析
IF：7+ 基于转录组水平上探究种植周炎和类风湿性关节炎的相似性和潜在关系:一项生物信息学研究的结果
IF：6+ 益气化瘀汤诱导胃癌铁死亡的网络药理学研究及实验验证
IF：11+ 鳞癌基因标记预测肺腺癌患者的预后和免疫治疗的敏感性
IF：7+ 免疫微环境中的免疫基因标记和免疫类型与胶质瘤的预后相关
IF: 8+ m6A调控因子与m6A相关的lnc/mRNA作为结直肠癌预后因子的综合性分析
IF: 6+ m6A信号与肿瘤免疫微环境在胶质瘤中的预后分析及验证
IF: 4+ 通过共表达网络鉴定急性心肌梗死患者血小板转录组关键基因模块和通路
IF：13+ Nomogram预测免疫检查点抑制剂治疗MSI-H型转移性结直肠癌患者的预后
IF：4+ 鉴定与股骨头坏死软骨氧化应激相关的Hub基因和通路
IF：伴FLT3-ITD突变的急性髓系白血病在米哚妥林治疗下的克隆进化
IF：8+ 小儿感染性休克的特征基因及与免疫细胞浸润的关系分析
IF: 8+ 基于单细胞 RNA-seq 构建非小细胞肺癌免疫反应的中性粒细胞预后模型
IF: 5+ 葡萄球菌核酸酶结构域含蛋白1 (SND1)在人类肿瘤中的致癌作用的泛癌分析
IF：6+ 综合分析揭示了一种炎症性癌症相关的成纤维细胞亚型在预测膀胱癌患者的预后和免疫治疗反应方面具有重要意义
IF: 25+ 单细胞转录组+scBCRseq联合分析研究癌症克隆结构和转录进化
IF: 13+基于scRNA-seq研究生物合成的微环境支架在小鼠皮肤伤口愈合中的应用
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