GATK:RNA-Seq

最新推荐文章于 2024-03-13 21:48:54 发布

Keiji1102

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比对工具：STAR

与TopHat相比，STAR灵敏度更高。使用STAR的two-pass mode比对可以使新型切割片段获得更好的比对结果。
第一次建立参考基因组

STAR --runMode genomeGenerate 
		--runThreadN 8
		--genomeDir ./star_index/
		--genomeFastaFiles ./genome/chrX.fa
		--sjdbGTFfile ./genes/chrX.gtf
		--sjdbOverhang INT(read length -1)

第一次序列比对

STAR --runThreadN 8
		--genomeDir ./star_index/
		--readFilesIn ./samples/chrX_1.fastq,gz  ./samples/chrX_2.fastq,gz 
		--readFilesCommand zcat
		--outFileNamePrefix ./star_1pass/chrX

根据第一次比对得到的所有剪切位点，第二次建立参考索引

STAR --runMode genomeGenerate
		--runThreadN 8
		--genomeDir ./star_index_2pass/
		--genomeFastaFiles   ./genome/chrX.fa
		--sjdbFileChrStartEnd ./star_1pass/chrX.out.tab

第二次序列比对

STAR --runThreadN 8
		--genomeDir ./star_index_2_pass/
		--readFilesIn ./samples/chrX_1.fastq,gz  ./samples/chrX_2.fastq,gz 
		--readFilesCommand zcat
		--outFileNamePrefix ./start_2pass/chrX

比对文件预处理

添加RG标签：AddOrReplaceReadGroups

java - jar picard.jar AddOrReplaceReadGroups
	I = ./start_2pass/chrXAligned.out.sam
    O = ./start_2pass/chrX_rg_added_sorted.bam
    SO = coordinate
    RGID = ERR188044
    RGLB = rna
    RGPL = illumina
    RGPU = hiseq
    RGSM = ERR188044

标记重复并排序：MarkDuplicates

java -jar picard.jar MarkDuplicates
	I = ./start_2pass/chrX_rg_added_sorted.bam
	O = ./start_2pass/chrX_dedup.bam
	CREATE_INDEX = true
	VALIDATION_STRINGENCY = SLIENT
	M = ./start_2pass/chrX_dedup.metrics

Call Variants

SplitNCigarReads
将落在外显子上的reads分离出来，取出N错误碱基，去除内含子区域的reads。

gatk SplitNCigarReads
	-R ./genome/chrX.fa
	-I ./start_2pass/chrX_dedup.bam
	-O ./start_2pass/chrX_dedup_split.bam

重新校正碱基质量值：baseRecalibrator、applyBQSR

gatk BaeRecalibrator
	-I ./start_2pass/chrX_dedup_split.bam
	-O  ./start_2pass/chrX_recal_data.table
	-R  ./genome/chrX.fa 
	--known-sites 1000G_phase1.snps.high_confidence.hg19.sites.vcf
	--known-sites  Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.sites.vcf

gatk ApplyBQSR
	-R ./genome/chrX.fa 
	-I ./start_2pass/chrX_dedup_split.bam
	-O ./start_2pass/chrX_BQSR.bam
	--bqsr-recal-file ./start_2pass/chrX_recal_data.table

检测变异：HaplotypeCaller

gatk HaplotypeCalller
	-R ./genome/chrX.fa 
	-I ./start_2pass/chrX_BQSR.bam
	-O ./start_2pass/chrX.vcf
	-dontUseSodtCilppedBases
	-stand_call_conf 20.0
	--dbsnp ${dbSNP_vcf}

变异过滤：VariantFiltration
RNA-Seq建议使用硬过滤。经过过滤的VCF，其中将通过的变体注释为PASS。

gatk VariantFiltration
	-R ./genome/chrX.fa 
	-V ./start_2pass/chrX.vcf
	-O ./star_2pass/chrX_filtered.vcf
	--filter-name FS
	--filter-expression "FS>30.0"
	--filter-name QD
	--filter-expression "QD<2.0"
	--window 35 
	--cluster 3