RNA甲基化修饰m6A简介及研究思路

RNA的化学修饰是细胞调控基因表达的重要机制之一。自20世纪中叶以来，科学家们陆续发现了多种RNA修饰类型，这些发现极大地丰富了我们对RNA功能的认识。从1951年在大肠杆菌RNA中识别出假尿嘧啶（Ψ），到1974年在mRNA的5'端发现m7G，再到1988年首次描述A-to-I编辑，这些里程碑式的发现为RNA修饰的研究奠定了基础。

图1. RNA修饰的里程碑事件[1]

特别引人注目的是m6A修饰，它最早是1955年在细菌DNA中被发现，在1974年首次在哺乳动物mRNA中被鉴定出，并迅速成为研究的焦点。随着技术的进步，2012年m6A的全转录组定位方法m6A-seq/meRIP-seq被开发，这为理解m6A修饰的动态调控提供了新的视角。随后，又有各种新的方法不断出现。今天我们的介绍也主要围绕m6A展开。

01  什么是m6A?

首先，什么是m6A？目前发现细胞RNA中已经识别到超过100种化学修饰，其中RNA甲基化修饰起着重要的作用。RNA甲基化，是指在甲基转移酶的催化下在RNA分子上的某一个原子上添加一个甲基基团（-CH3）。m6A修饰是以S腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，在甲基转移酶（METTL3）复合体的作用下将甲基（-CH3）转移到RNA腺嘌呤苷酸的N6位置形成的。这种修饰在真核生物中广泛存在，包括人类、小鼠、果蝇、酵母等。m6A修饰通常由“甲基转移酶复合物”实现，包括“写入”酶、如METTL3、METTL14和WTAP，以及“擦除”酶，如FTO和ALKBH5。

图2. mRNA中可逆化的m6A修饰 [2]

02  为什么要研究m6A?

m6A (N6-methyladenosine)是真核生物mRNA上最普遍的RNA修饰之一，广泛参与调控基因表达的多个层面，包括mRNA的剪接、稳定性、运输和翻译。m6A修饰的动态变化与多种生物学过程密切相关，如细胞分化、发育、脑功能以及疾病发生等。此外，m6A修饰的异常与多种疾病，包括癌症、神经退行性疾病和心血管疾病等有着直接联系，使其成为潜在的治疗靶点和生物标志物。因此，深入研究m6A修饰不仅有助于我们理解生命现象的分子机制，还为疾病诊断、治疗和药物开发提供了新的策略和方向。

图3.疾病中m6A相关RNA调节蛋白的致病性失调[3]

m6A在植物研究中同样具有重要价值，它参与调控植物的生长发育、逆境响应和生殖过程。通过研究m6A修饰，可以更深入地了解植物如何通过调整基因表达来适应环境变化，例如干旱、盐分胁迫等。此外，m6A修饰对植物遗传多样性和表型变异的贡献，为作物改良和提高作物产量提供了新的策略，有助于培育出更适应未来气候变化的作物品种。

图4.m6A修饰介导的RNA代谢影响植物的发育和胁迫反应[4]

03   m6A研究方法——meRIP-seq

Methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (MeRIP-Seq, 也称作m6A-Seq)，该方法是基于特异性抗体特异性结合甲基化修饰的碱基的原理，以RNA免疫共沉淀富集甲基化修饰片段为基础，然后通过高通量测序，在全转录组范围内研究发生甲基化的RNA区域。MeRIP-seq技术为研究m6A修饰在RNA生物学和疾病中的作用提供了一个强大的工具，它是目前研究m6A修饰使用最广泛的技术之一。有需要详细了解的老师可以看看我们往期推文《技术贴 | RNA甲基化修饰m6A的检测——MeRIP-seq》。

图5.meRIP-seq流程[5]

04   m6A研究思路

目前m6A的应用方向分为以下3大方向：

根据相应的研究方向，可以参考的研究思路如下：

05     研究案例

• 案例一：小鼠卵母细胞和着床前胚胎的m6A动态修饰图谱[6]

• 研究材料：

小鼠49-110个GV (germinal vesicle)  和MII (metaphase II) 时期的卵子以及受精卵（zygote）、2细胞（2-cell）、8细胞（8-cell）、囊胚（blastocyst）时期的胚胎研究方法：picoMeRIP-seq研究内容：

本研究通过应用低起始量的甲基RNA免疫沉淀和测序技术（picoMeRIP-seq），成功绘制了小鼠卵母细胞和着床前胚胎中N6-甲基腺苷（m6A）修饰的动态图谱，揭示了m6A修饰在调控早期胚胎发育、基因表达、母体到合子转换过程中的关键作用，以及其在逆转录子RNA上的显著富集，为深入理解m6A修饰在哺乳动物早期发育中的调控机制提供了宝贵的数据资源和科学见解。

图6.小鼠卵母细胞和胚胎的RNA m6A图谱

• 案例二：m6A 阅读蛋白YTHDF1调控ZNF839 翻译促进骨髓间充质干细胞成骨[7]

• 研究方法：

CRISPR-Cas9基因敲除,rt-pcr,wb,RIP-seq,MeRIP-Seq,荧光素酶报告基因分析，免疫组化，免疫荧光

• 研究路线：

• 研究内容：

本研究通过构建Ythdf1基因敲除小鼠模型并结合体外细胞实验，探讨了m6A reader蛋白YTHDF1及其下游靶基因ZNF839在骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用。研究发现，YTHDF1通过识别并翻译调控ZNF839蛋白，进而增强Runx2的转录活性，促进BMSCs成骨分化。此外，Ythdf1基因敲除小鼠表现出骨量减少，进一步证实了YTHDF1在体内骨形成中的重要性。这些发现不仅揭示了m6A修饰在BMSCs成骨分化中的调控机制，而且为骨质疏松症的预防和治疗提供了新的视角和潜在靶点。

ZNF839是一个与YTHDF1结合的m6A修饰基因

• 案例三：梨响应火疫病过程中RNA m6A动态变化的多组学分析[8]

• 研究材料：

健康和接种病原体的梨幼苗研究方法：RNA-seq+MeRIP-seq

• 研究内容：

本文通过多组学分析方法，研究了梨（Pyrus bretschneideri）在响应火疫病病原体Erwinia amylovora感染时，RNA N6-甲基腺苷（m6A）修饰的动态变化。研究团队利用MeRIP-seq和RNA-seq技术，分析了健康和接种病原体的梨植株的转录组数据，以评估梨在应对病原体侵染时的转录水平变化和m6A修饰的后转录调控。研究发现m6A倾向于修饰重复基因而非单基因，并且m6A修饰的基因经历了更强的纯化选择。通过分析97,261个m6A峰，研究者们鉴定了2,935个特定的m6A位点，这些位点在接种后可能增加了与防御相关的转录本丰度，从而增强了梨的抗性。此外，研究还发现m6A甲基化程度与转录水平显著正相关，表明m6A在植物响应中具有调控作用。该研究为理解m6A在植物防御反应中的作用提供了新的见解，并为未来在植物病害抗性方面的分子育种策略提供了重要信息。

梨的m6A甲基化图谱

06    产品推广

最后，m6A RNA甲基化我们能提供哪些相关产品呢？

1)整体水平检测，可提供Dot-blot和LC-MS/MS；

2)转录组水平的检测，可提供基于特异性抗体的测序技术MeRIP-seq;

3)单基因m6A位点检测技术，可提供MeRIP-qPCR，SELECT。

• 项目物种经验：

医口 项目	人，大鼠，小鼠
动物 项目	鸡，猪，牛，短趾百灵鸟，罗非鱼，黄鳝，斑马鱼，秀丽隐杆线虫…
植物 项目	大豆，桂花，秋茄，樟树，番茄，杨树，苹果，拟南芥，刺梨，棉花，水稻，木麻黄，火炬松，青稞，碎米荠…

• 参考文献：

1.Liu WW, Zheng SQ, Li T, Fei YF, Wang C, Zhang S, Wang F, Jiang GM, Wang H. RNA modifications in cellular metabolism: implications for metabolism-targeted therapy and immunotherapy. Signal Transduct Target Ther. 2024 Mar 27;9(1):70. doi: 10.1038/s41392-024-01777-5. PMID: 38531882; PMCID: PMC10966055.

2.Huang H, Weng H, Chen J. m6A Modification in Coding and Non-coding RNAs: Roles and Therapeutic Implications in Cancer. Cancer Cell. 2020 Mar 16;37(3):270-288. doi: 10.1016/j.ccell.2020.02.004. PMID: 32183948; PMCID: PMC7141420.

3.Liu Y, Yang D, Liu T, Chen J, Yu J, Yi P. N6-methyladenosine-mediated gene regulation and therapeutic implications. Trends Mol Med. 2023 Jun;29(6):454-467. doi: 10.1016/j.molmed.2023.03.005. Epub 2023 Apr 15. PMID: 37068987.

4.Shao Y, Wong CE, Shen L, Yu H. N6-methyladenosine modification underlies messenger RNA metabolism and plant development. Curr Opin Plant Biol. 2021 Oct;63:102047. doi: 10.1016/j.pbi.2021.102047. Epub 2021 May 6. PMID: 33965696.

5.Dominissini D, Moshitch-Moshkovitz S, Schwartz S, Salmon-Divon M, Ungar L, Osenberg S, Cesarkas K, Jacob-Hirsch J, Amariglio N, Kupiec M, Sorek R, Rechavi G. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 2012 Apr 29;485(7397):201-6. doi: 10.1038/nature11112. PMID: 22575960.

6.Wang Y, Li Y, Skuland T, Zhou C, Li A, Hashim A, Jermstad I, Khan S, Dalen KT, Greggains GD, Klungland A, Dahl JA, Au KF. The RNA m6A landscape of mouse oocytes and preimplantation embryos. Nat Struct Mol Biol. 2023 May;30(5):703-709. doi: 10.1038/s41594-023-00969-x. Epub 2023 Apr 20. PMID: 37081317; PMCID: PMC10337017.

7.Liu T, Zheng X, Wang C, Wang C, Jiang S, Li B, Chen P, Xu W, Zheng H, Yang R, Huang X, Zhang X, Jiang L. The m6A "reader" YTHDF1 promotes osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells through translational control of ZNF839. Cell Death Dis. 2021 Nov 12;12(11):1078. doi: 10.1038/s41419-021-04312-4. PMID: 34772913; PMCID: PMC8590051.

8.Han C, Zhang F, Qiao X, Zhao Y, Qiao Q, Huang X, Zhang S. Multi-Omics Analysis Reveals the Dynamic Changes of RNA N 6 -Methyladenosine in Pear (Pyrus bretschneideri) Defense Responses to Erwinia amylovora Pathogen Infection. Front Microbiol. 2022 Feb 10;12:803512. doi: 10.3389/fmicb.2021.803512. PMID: 35222304; PMCID: PMC8867029.