你知道红细胞基因对单细胞分析的影响吗

大家好，今天周日。最近发现有些单细胞测序数据结果不是很好，或许在作者取样的时候，就注定了后续的生信分析不会太成功~

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本次主要发现一个数据集中出现一大群红细胞基因高表达亚群，对后续分析影响还是挺大的。下面先介绍一下为啥单细胞测序前，我们通常要去除红细胞

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1 单细胞测序之前的样本处理流程

下图是单细胞测序之前的样本处理流程

对于组织解离出来的细胞悬液，其质控主要采取对细胞悬液进行台盼蓝染色观察为主。若组织块消化完全，显微镜下观察细胞无成团或聚集现象，细胞悬液即为达标；同时单细胞实验要求细胞悬液符合以下标准：①细胞活性>85%；②细胞总数> 20000；③杂质或红细胞占比小于20%

对于离心重悬后的获取到的细胞悬液，如果红细胞占比大于20%，则需要进行红细胞裂解步骤，裂红后细胞悬液需通过镜检判断红细胞是否裂解彻底，若红细胞数量依然大于20%，则需要二次裂红处理；若红细胞占比小于10%可以直接清洗重悬镜检。

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2 我们不禁要问下面两个问题：

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1. 为什么单细胞测序过程中要去除红细胞？

2. 如果红细胞没有去除干净，在后续分析时，出现大量红细胞基因高表达亚群咋办？   

为什么单细胞测序过程中要去除红细胞：

1. 由于红细胞不包含核糖体，其RNA序列主要由血红蛋白基因(HBB)组成，这些序列对于我们研究其他细胞的基因表达没有太多意义，因此会降低其他细胞的RNA测序效率。

2. 测序深度的固定：在单细胞测序中，通常会设定一个固定的总测序深度，即总测序的数据量是一定的。如果样本中存在大量的红细胞，它们的RNA序列会占据较大比例的总测序深度，从而减少其他细胞的测序深度。这就意味着其他细胞的RNA序列被稀释了，其表达水平可能无法准确地检测和分析。

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在后续分析时，出现大量红细胞基因高表达亚群咋办：  

1. 数据过滤和筛选：通过对单细胞测序数据进行筛选和过滤，将红细胞基因高表达的细胞排除在分析之外。

2. 数据纠正和规范化：使用专门的数据纠正方法，如Scrublet、SoupX等，对红细胞干扰进行更精确的估计和消除。这些方法可以校正红细胞引起的扭曲，减少其对其他细胞的影响。

3. 细胞亚群分析：如果红细胞基因高表达的亚群数量较少，可以将其视为一个独立的细胞亚群进行分析。这样可以避免红细胞的影响对其他细胞群体的解读造成干扰。

我发现使用SoupX这个工具比较方便，就三句代码，大家可以去官网自己看看：

#https://github.com/constantAmateur/SoupX#https://rawcdn.githack.com/constantAmateur/SoupX/204b602418df12e9fdb4b68775a8b486c6504fe4/inst/doc/pbmcTutorial.htmlsc = load10X('path/to/your/cellranger/outs/folder')sc = autoEstCont(sc)out = adjustCounts(sc)

但是，

我觉得最好的办法：单细胞测序前尽可能地去除红细胞，以避免这类问题的出现。

最后，祝各位在分析实战过程中，都能得偿所愿，顺利发表~

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看完记得顺手点个“在看”哦！